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以HIV-1启动子为靶点的药物筛选系统的构建与应用

作　者: 郭文涛
导　师: 赵国强
学　校: 郑州大学
专　业: 病原生物学
关键词: HIV-1启动子报告基因抗HIV/AIDS药物药物体外筛选血清药理学假病毒
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

背景和目的AIDS是由于HIV感染后引起的一种免疫缺陷性疾病。HIV-1既可以利用宿主的调节机制进行转录调节,也能编码产生一些调节蛋白进行自我的调控。在HIV-1基因组LTR区存在着和各种转录因子的结合位点,各种调节蛋白通过和DNA相互作用以及蛋白间的相互作用形成一个复杂的调节网络,调节病毒结构蛋白和非结构蛋白的表达。针对HIV-1 LTR区以及宿主细胞中HIV-1表达调节蛋白的研究,为研制抗AIDS药物提供了新的方式。中药在抗HIV/AIDS上具有特有的优势,但由于缺乏科学有效的筛选手段,使得抗HIV/AIDS中药在应用和疗效上严重落后于西药。如何从丰富的中药资源宝库中筛选出有效的抗HIV/AIDS药物,是急需解决的问题。本研究拟建立一种新的方法,利用报告基因技术筛选作用于HIV-1启动子靶点的能够潜在抗HIV/AIDS的药物,并通过假病毒方法来验证所建立的药物筛选系统。方法将设计合成的HIV-1核心启动子双链序列克隆进pGL4.17萤光素酶报告载体中,通过双酶切以及DNA测序验证后得到pGL4.17-HIV1P阳性重组载体；采用脂质体包裹转染将pGL4.17-HIV1P转入HT-H9细胞中,通过G418筛选出稳定的转染细胞株,扩大培养后进行分组；将4种中药(杜仲、黄芩、苦参、双黄连)给大鼠灌胃后采血,分离含药血清,同时用0.9%氯化钠灌胃的老鼠血清作为对照,将不同含药血清分别作用于各组细胞后,通过检测萤光素酶活性来反映HIV-1启动子表达水平,构建以HIV-1启动子为靶点的药物筛选系统。将假病毒载体pNL4-3.luc.R-E-转染293T细胞,用不同含药学清作用各组细胞后,通过ELISA法检测p24蛋白表达量,验证所建立的筛选系统的可靠性。实验结果用统计学软件SPSS13.0分析。结果1将设计合成的HIV-1核心启动子序列克隆到pGL4.17载体后,经双酶切和测序鉴定显示和设计序列完全一致,得到阳性重组载体pGL4.17-HIV1P。2将载体pGL4.17-HIV1P转染HT-H9细胞后,用G418筛选得到稳定转染的细胞株。3萤光素酶检测结果显示：苦参组细胞萤光值为1110780.5±15076.6,杜仲组为864557.5±15441.9,黄芩组为1054500.5±26279.0,与对照组萤光值291089.6±10457.7相比,萤光值显著升高(P<0.01)；双黄连组萤光值为225858.4±14257.7,与对照组相比显著降低(P<0.01)4用ELISA法检测p24蛋白含量,结果显示：苦参组细胞的OD值为2.267±0.159,杜仲组为1.851±0.076,黄芩组为2.04,4±0.122,与对照组1.403±0.024相比OD值显著升高(P<0.01)；双黄连组OD值为1.042±0.023,与对照组相比显著降低(P<0.01)。p24蛋白含量检测结果和萤光素酶检测结果正相关。结论1成功构建含有HIV-1核心启动子序列的萤光素酶报告基因载体,建立了以HIV-1启动子为靶点的药物体外筛选系统,并通过假病毒方法验证了该系统的可行性。2利用该系统筛选药物显示双黄连能够显著降低HIV-1启动子的活性,说明它具有潜在的抗HIV/AIDS作用。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
中英文缩略词表  11-12
论文题目以HIV-1启动子为靶点的药物筛选系统的构建与应用  12-43
  1 引言  12-15
  2 实验材料  15-20
    2.1 菌株、细胞株、实验动物  15
    2.2 实验试剂  15
    2.3 载体  15-17
    2.4 实验中常用试剂和细胞培养基的配置  17-19
    2.5 实验用到的主要仪器设备  19-20
  3 实验方法  20-30
    3.1 HIV-1启动子萤光素酶报告载体的构建和鉴定  20-24
    3.2 体外筛选系统的建立  24-25
    3.3 体外筛选系统对药物进行初步筛选  25-28
    3.4 用假病毒载体对体外筛选系统进行验证  28-29
    3.5 数据处理  29-30
  4 实验结果  30-36
    4.1 pGL4.17-HIV1P质粒的构建  30-31
    4.2 pGL4.17-HIV1P质粒鉴定结果  31-32
    4.3 pGL4.17-HIV1P萤光素酶活性测定结果  32-33
    4.4 药物刺激筛选系统后萤光素酶活性检测结果  33-34
    4.5 ELISA检测结果  34-36
  5 讨论  36-40
    5.1 以HIV-1启动子为筛选靶点的现实意义  36
    5.2 血清药理学的应用  36-37
    5.3 本筛选系统建立的可行性  37-38
    5.4 萤光素酶检测结果讨论  38-39
    5.5 p24蛋白检测结果讨论  39
    5.6 该系统对传统中药应用的意义和前景  39-40
  6 结论  40-41
  参考文献  41-43
综述 HIV-1 LTR区结构和功能的研究进展  43-61
  参考文献  55-61
致谢  61-62
个人简介  62
已发表和待发表论文  62

以HIV-1启动子为靶点的药物筛选系统的构建与应用

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