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应用急性病毒性坏死病毒（AVNV）分子检测技术对其主要宿主的检测与分析

作　者: 蔡玉勇
导　师: 王崇明；李赟
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水生生物学
关键词: 栉孔扇贝急性病毒性坏死病毒宿主范围浮游生物附着生物
分类号: S944.43
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

栉孔扇贝(Chlamys farreri)是我国北方沿海养殖的主要贝类品种之一。“急性病毒性坏死病毒”(Acute Viral Necrosis Virus; AVNV)已被证实为是一种对养殖栉孔扇贝危害极大的病原体。本文应用已建立的AVNV核酸检测方法,对养殖扇贝、养殖海区浮游生物、养殖笼附着污损生物以及全国9省21个海区采集到的养殖贝类样品进行检测与分析,以探讨AVNV的主要宿主分布以及可能的传播途径。本文应用AVNV环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)对两个不同栉孔扇贝养殖海区的扇贝进行连续周年检测,研究AVNV在扇贝体内的感染增殖规律以及探讨综合生态调控技术对扇贝流行病控制效果。检测结果表明,08、09两年青岛流清河养殖海区扇贝样品在夏季大规模死亡季节均能检测到较高的AVNV携带率,其中08年5月-09年4月野生苗种扇贝8月份阳性率最高,达到75%,全年平均携带率为35%；09年1月-12月三种扇贝苗种蓬莱红、人工育苗和野生苗,7月份AVNV携带率最高分别为20%、70%和80%,扇贝携带AVNV的阳性率与扇贝大规模死亡流行病学的特征具有正相关性,而高温(7月和8月份海温度水平均23℃以上)可能是导致AVNV感染扇贝死亡的重要环境胁迫因子；桑沟湾扇贝养殖海区属于贝藻混养海区,由于部分苗种来源问题,桑沟湾检测到AVNV携带率最高时间为4月份扇贝分苗挂养时,蓬莱红、人工育苗和野生苗AVNV携带率分别为50%、60%和0,野生苗5月、6月AVNV携带率最高均为30%。09年流清河扇贝养殖场蓬莱红、人工育苗、野生苗存活率分别为39.1%、40.7%、45.3%；桑沟湾扇贝养殖场蓬莱红、人工育苗、野生苗存活率分别为96.8%、89.2%、90%,表明贝藻混养的养殖模式较单一养殖模式能利用大型藻类对扇贝养殖环境的生态调控,可以显著地降低病原水平,降低扇贝发病率。对09年对青岛流清河与荣成桑沟湾两个不同的扇贝养殖海区浮游生物采样调查,研究浮游生物是否能携带AVNV及其变化情况。利用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR, FQ-PCR)技术对不同粒径的浮游生物携带AVNV进行定量检测,结果表明两个扇贝养殖海区均检测到AVNV阳性样品存在,而且不同粒径的浮游生物携带AVNV量有差异,粒径小于200目的浮游生物携带AVNV的量最大,达到9.45×106拷贝/mg总DNA,粒径60目—200目的之间浮游生物次之,粒径大于60目的浮游生物携带量最少,仅为5.81×104拷贝/mg总DNA。在上述两个扇贝养殖海区,均在8月份检测到浮游生物携带AVNV,与栉孔扇贝夏季大规模死亡现象在时间上吻合。实验结果表明：浮游生物可以携带AVNV,可能在AVNV的流行和传播中起到传播媒介的作用。对09年两个不同的扇贝养殖海区养殖扇贝扇贝笼上经常出现的几种附着污损生物检测其能否携带AVNV,是否是AVNV的潜在宿主,探讨附着污损生物在AVNV传播过程中起到有什么作用。两个海区中长牡蛎、紫贻贝、柄海鞘和麦秆虫样品中均检测到AVNV阳性的存在,青岛流清河扇贝养殖海区的东方缝栖蛤未检测到AVNV阳性样品存在,表明长牡蛎、紫贻贝、柄海鞘和麦秆虫可以携带AVNV,是AVNV的宿主,东方缝栖蛤未检测到AVNV,可能不是AVNV的宿主。自06年11月至09年11月从中国沿海9个省21个海区共采集38批586份样品,包括20种主要养殖贝类,其中双壳纲贝类16种,腹足纲4种。检测这些贝类样品携带AVNV的携带情况,除栉孔扇贝以外有8种贝类样品可以携带AVNV,说明AVNV在养殖贝类中有较广泛的宿主范围,包括：虾夷扇贝、华贵栉孔扇贝、杂色蛤、紫贻贝、翡翠贻贝、长牡蛎、近江牡蛎和方斑东风螺等；共有11种贝类样品未检测到AVNV阳性样品存在,这些样品包括海湾扇贝、波纹巴非蛤、文蛤、泥蚶、黄边糙鸟蛤企鹅珍珠贝、马氏珠母贝、黑碟贝、皱纹盘鲍、黑鲍和泥螺,但是受到采样地点、时间和样品数量的限制,这些样品能否携带AVNV还有待于进一步研究。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
第一章前言  11-26
  1.1 AVNV研究进展  13-15
    1.1.1 AVNV流行病学特征  13
    1.1.2 AVNV病原学研究  13-14
    1.1.3 AVNV病理学研究  14-15
  1.2 AVNV检测技术的研究进展  15-21
    1.2.1 酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)  15-16
    1.2.2 间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence,IIF)  16-17
    1.2.3 聚合酶链式反应(Polymerase Chain R$eaction,PCR)  17-18
    1.2.4 环介导等温扩增法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)  18-19
    1.2.5 荧光定量PCR技术  19-21
  1.3 水生动物病毒性疾病传播途径的研究  21-25
    1.3.1 垂直传播途径  21-23
    1.3.2 水平传播途径以及宿主范围  23-25
  1.4 综合生态调控技术对扇贝养殖疾病控制作用  25
  1.5 本论文研究目的和意义  25-26
第二章栉孔扇贝携带AVNV调查与贝藻混养养殖效果  26-38
  2.1 材料与方法  26-29
    2.1.1 实验材料  26-27
    2.1.2 DNA模板样品制备  27-28
    2.1.3 LAMP检测  28
    2.1.4 LAMP产物检测  28-29
    2.1.5 综合生态调控技术对疾病控制效果  29
  2.2 实验结果  29-34
    2.2.1 扇贝模板DNA检测  29-30
    2.2.2 LAMP检测  30-31
    2.2.3 样品检测结果  31-34
  2.3 讨论  34-38
第三章浮游生物携带AVNV检测  38-45
  3.1 材料与方法  38-39
    3.1.1 材料  38
    3.1.2 DNA模板样品制备  38-39
    3.1.3 FQ-PCR检测  39
  3.2 结果与分析  39-43
    3.2.1 浮游生物种类及生物量统计  39-40
    3.2.2 浮游生物AVNV检测  40-41
    3.2.3 不同粒径浮游生物AVNV携带量分析  41-43
  3.3 讨论  43-45
第四章扇贝污损生物携带AVNV调查  45-50
  4.1 材料与方法  46
    4.1.1 实验材料  46
    4.1.2 DNA模板样品制备  46
    4.1.3 LAMP检测  46
  4.2 结果  46-48
    4.2.1 附着污损生物的时间分布  46-47
    4.2.2 所有样品检测结果  47-48
  4.3 讨论  48-50
第五章中国沿海养殖贝类AVNV感染状况调查  50-60
  5.1 实验材料  50-52
    5.1.1 定点调查与样品采集  50-52
    5.1.2 实验材料  52
    5.1.3 DNA模板样品制备  52
    5.1.4 LAMP检测  52
  5.2 结果  52-58
    5.2.1 所有批次样品检测结果  52-55
    5.2.2 不同品种贝类检测结果  55-56
    5.2.3 AVNV分布地区差异  56-58
  5.3 讨论  58-60
参考文献  60-65
致谢  65-66

应用急性病毒性坏死病毒（AVNV）分子检测技术对其主要宿主的检测与分析

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