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复方大青叶注射液对HIV侵入和复制的作用

作　者: 臧玉翠
导　师: 赵国强
学　校: 郑州大学
专　业: 医学免疫学
关键词: 复方大青叶注射液 CXCR4/CCR5启动子 HIV 假病毒 p24蛋白艾滋病
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景和目的获得性免疫缺陷综合症（Acquired Immure Deficiency Syndrome）,简称AIDS,是由人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus, HIV）所引起的传染性疾病,能够导致人体的免疫功能降低或丧失,最终发生机会性感染和形成恶性肿瘤,直至死亡。在病毒感染过程中,CD4+T细胞是其攻击的主要靶细胞,而CXCR4/CCR5则是HIV感染CD4+T细胞的关键辅助受体。近年来,以辅助受体为靶点的抗艾滋病药物成为一个新的药物设计目标,在HIV感染的早期阶段起重要作用。大青叶是我国传统中药,属于十字花科草本植物,味苦、性寒,具有清热、解毒和凉血之功效,所含化学成分有靛蓝、靛玉红、色氨酮、3-羟苯基喹唑酮、有机酸类等。大青叶具有抗炎抗病毒和提高免疫力等作用,近年来在临床上应用广泛。据文献报道,大青叶在抗流感病毒,柯萨奇病毒,乙型脑炎病毒,单纯疱疹病毒,扁平疣病毒方面疗效显著。作为一种能够有效对抗多种病毒的中药,是否具有抗艾滋病的作用及其可能的作用机制有待于进一步探索和研究。本实验通过复方大青叶注射液对体外培养HT-H9细胞中CXCR4/CCR5启动子活性作用的研究,以了解其是否能够通过作用于CXCR4/CCR5启动子,下调蛋白的表达,以达到抑制病毒入侵的作用。同时,将复方大青叶注射液用于HIV假病毒pNL4-3.luc.R-E-做进一步的验证,观察其在抑制病毒复制方面的活性,以转染细胞的相对荧光素酶活性（RLU）和p24蛋白含量作为评价抑制病毒复制效果的依据,检测复方大青叶注射液是否对病毒的复制存在抑制作用。方法采用脂质体转染法将CXCR4/CCR5启动子的报告基因载体pGL4.17-CXCR4/pGL4.17-CCR5分别转染入HT-H9细胞株,经G418筛选,获得稳定转染细胞株,扩大培养；对细胞进行分组,分为高剂量实验组,低剂量实验组,生理盐水组和空白对照组,各组细胞经复方大青叶注射液处理24h后,通过荧光素酶活性检测来分析各组细胞中CXCR4/CCR5启动子的活性。假病毒载体pNL4-3.luc.R-E-和内参质粒phRL-SV40瞬时转染HEK293T细胞,细胞分组,分为复方大青叶注射液高剂量组、低剂量组、生理盐水组和空白对照组,同时加入AZT组作为阳性对照；复方大青叶注射液作用于细胞24h后,检测瞬时转染293T细胞中报告基因荧光素酶的表达活性,同时ELISA法检测细胞培养上清中HIV₁p24蛋白的含量来进一步验证药物抑制病毒复制的效果。各实验数据采用统计软件SPSS13.0进行处理。结果1.质粒pGL4.17-CXCR4/pGL4.17-CCR5转染入HT-H9细胞,G418筛选获得稳定转染细胞株。2.HT-H9细胞萤光素酶活性的检测结果显示：CXCR4实验组中复方大青叶注射液高剂量组与低剂量组的荧光值均明显低于对照组荧光值,且与对照组相比,差异显著（P<0.01）；CCR5实验组中,高剂量组的荧光素酶值较对照组降低,与对照组相比有显著差异（P<0.05）,低剂量组荧光素酶活性值与对照组之间差异不明显（P>0.05）。3.HEK293T细胞荧光素酶活性检测结果：低剂量实验组的RLU与空白组接近,二者相比,差异无统计学意义（P>0.05）；高剂量实验组RLU较空白组降低,且与空白组相比,差异显著（P<0.01）；高剂量实验组较AZT组RLU升高,二者相比,差异有统计学意义（P<0.05）。4.ELISA检测p24抗原含量结果：低剂量实验组的p24蛋白浓度略低于空白组,二者相比差异无统计学意义（P>0.05）；复方大青叶注射液高剂量组p24蛋白浓度明显低于空白组,与之相比,差异显著（P<0.01）；高剂量组与AZT组对比,差异有统计学意义（P<0.05）。结论1.高剂量复方大青叶注射液能够同时降低体外培养HT-H9细胞中CXCR4和CCR5启动子的活性,推测其能够间接起到抑制病毒入侵的作用,具有潜在的抗艾滋活性。2.复方大青叶注射液能够显著降低pNL4-3.luc.R-E-瞬时转染HEK293T细胞的相对荧光素酶活性,且细胞培养上清中p24蛋白表达水平也显著降低,推测其具备潜在的抑制HIV复制的作用。

全文目录

摘要  4-7
Abstract  7-12
中英文缩略词汇对照  12-13
引言  13-16
1 实验材料  16-20
2 实验方法  20-25
3 结果  25-31
4 讨论  31-37
5 小结  37-38
参考文献  38-41
综述一 HIV-1易感性的基因组学研究进展  41-49
  参考文献  47-49
综述二急性HIV-1感染时期病毒的进化和逃逸  49-60
  参考文献  56-60
致谢  60-61
个人简介  61
在读期间发表论文  61

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