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埃博拉病毒包膜蛋白GP细胞毒性机理研究

作　者: 张桂根
导　师: 蒋澄宇
学　校: 北京协和医学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: EBO-Zaire GP1蛋白血管内皮细胞细胞毒性埃博拉假病毒包膜蛋白 DNA疫苗
分类号: R373
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

埃博拉病毒包膜蛋白GP细胞毒性机理探讨埃博拉病毒(Ebola virus)属于丝状病毒科(Filoviridae),为单股负链RNA包膜病毒,分4个亚型,即埃博拉-扎伊尔型(EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型(EBO-Sudan)、埃博拉-莱斯顿型(EBO-Reston)和埃博拉-科特迪瓦型(EBO-Ivory Coast)。埃博拉病毒能够引起人严重出血热(Ebola hemorrhagic fever, EHF),被列为生物安全第四级(Biosafety Level 4)病毒,其中EBO-Zaire致死率高达90%。埃博拉病毒包膜蛋白GP (Glycoprotein)是唯一的表面包膜蛋白,在介导病毒进入细胞过程中发挥重要作用,同时GP被认为是决定埃博拉致病性一个重要因素。研究表明,体外通过转染表达GP基因的质粒或腺病毒转染GP基因进入宿主细胞,能够导致宿主细胞的脱落,表明埃博拉病毒包膜蛋白GP具有细胞毒性,但是其机理不详(1)。弥漫性血管内凝血(Disseminated Intravascular Coagulation,DIC)是埃博拉出血热的主要特征之一,血管内皮细胞被认为埃博拉病毒的致病机理中发挥着重要作用,有报道表明埃博拉病毒包膜蛋白是导致血管内皮细胞的结构和功能异常重要因素(1)。本研究论文通过体外表达和纯化EBO-Zaire包膜蛋白GP亚单位GP1-Fc融合蛋白,将纯化的包膜蛋白加入到人脐静脉内皮细胞(HUVECs),首次发现纯化的包膜蛋白GP1能够引起内皮细胞的脱落。实验表明在蛋白终浓度为800 nmo1-1时,内皮细胞脱落现象比较明显,并且在蛋白处理后24 h小时,内皮细胞开始出现脱落现象。因此,本研究首次在体外建立了GP1蛋白引起人脐静脉内皮细胞脱落的细胞毒性模型,并且发现GP1蛋白能够引起HUVECs的血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)上调,但具体机理仍然不清楚。并且已提取HUVECs细胞mRNA,拟通过二代测序的方法探讨GP1蛋白引起人脐静脉内皮细胞脱落的机理。鉴于埃博拉病毒的高致病性和传染性,埃博拉假病毒能够代替活病毒的部分研究,本实验探讨通过三质粒共转和二质粒共转的方法包装埃博拉假病毒的可行性。通过共转染pQCXIX(含GFP报告基因),gag/pol质粒和pEAK13GP三个质粒包装表达GFP报告基因的埃博拉假病毒；通过共转染pNL4-3.Luc.R-E-和pEAK13GP两个质粒包装表达荧光素酶报告基因的埃博拉假病毒。实验表明三质粒共转包装的埃博拉假病毒滴度较低,二质粒共转包装假病毒感染293T细胞后荧光素酶报告基因的表达较高。研制包膜蛋白GP抗体,对于埃博拉病毒的致病机理以及药物研发方面均有非常重要的作用,但是市场上至今没有相应的埃博拉病毒GP单克隆抗体销售,本实验探讨埃扎伊尔-埃博拉病毒(Zaire Ebola virus)包膜蛋白(GP) DNA疫苗诱导小鼠产生中和抗体的特性及研制埃博拉病毒DNA疫苗的可行性。通过构建埃博拉病毒包膜蛋白GP真核表达质粒pEAK13CD5LGP,采用100μg剂量的质粒免疫小鼠,以纯化的埃博拉病毒包膜蛋白亚单位融合蛋白(GP1-Fc)作为抗原,通过ELISA检测及Western blot验证测定血清抗体滴度及特异性。实验表明100μg质粒免疫小鼠三次后,小鼠血清中GP中和抗体滴度达到1：2000。含埃博拉病毒包膜蛋白GP基因的DNA疫苗(pEAK13CD5LGP)能够诱导小鼠产生高滴度和持久的中和抗体,作为埃博拉病毒疫苗具有潜在的应用价值。

埃博拉病毒包膜蛋白GP细胞毒性机理研究

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