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建立共表达GM-CSF、IL-4的EA.hy926内皮细胞系并诱导单核细胞向树突状细胞分化的研究

作　者: 石晓月
导　师: 王字玲; 于群
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 树突状细胞共培养饲养层共表达
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

树突状细胞(Dendritic cells,DCs)是目前所知功能最强的、也是唯一能激活初始性T细胞(NT cell)的专职抗原提呈细胞(Antigen-presenting cell,APC),在免疫应答中处于中心地位。临床和研究中的DCs通常是人外周血单核细胞(peripheral blood monouclear cell,PBMC)在细胞因子GM-CSF、IL-4作用下体外诱导一周得到。但是有研究人员提出这种细胞因子来源的DCs缺乏功能的完整性,而模拟DCs在体内的分化过程,在体外诱导DCs前体细胞向DCs的分化,对DCs功能的研究更具意义。在体内短期循环的单核细胞在炎症或损伤信号的刺激下,穿越血管内皮细胞进入外周组织到达炎症位点,同时分化为DCs并进一步成熟。基于内皮细胞提供的微环境在DC的发育中的重要作用,Randolph课题组最早提出了单核细胞-内皮细胞穿越模型,PBMCs通过两次穿越原代人脐静脉血内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)分化为APCs,该细胞在功能和表型上都与DCs相似。但是该方法操作复杂,使得其应用受到极大的限制。而Schanen利用transwell技术将HUVECs与外周血单核细胞进行共培养,在PBMCs单向穿越HUVECs细胞层后成功获得DCs,培养过程不需要加入外源细胞因子,分化时间仅为两天。但是以上培养系统存在着较大的缺点,即HUVECs是原代细胞,分离时操作繁琐,在体外培养需要加入细胞因子,传代次数较少,不适于长期使用。本研究提出了构建分泌GM-CSF、IL-4的内皮细胞系EA.hy926来诱导PBMCs的分化。EA.hy926细胞是由HUVECs和人肺癌A549细胞融合得到,具有HUVEC的部分特征,可在不加入外源细胞因子的条件下在体外长期传代,遗传背景单一,避免了原代细胞培养的缺点。通过慢病毒重组系统将GM-CSF、IL-4的基因重组进入EA.hy926细胞的基因组中,达到提高两个细胞因子表达的目的,该细胞系将对DC的分化培养具有重要的意义。本论文成功构建了GM-CSF、IL4慢病毒共表达质粒;包装获得的重组慢病毒可以高效的感染内皮细胞系EA.hy926,感染后的EA.hy926经实时定量PCR、Western bloting及ELISA等多种方法进行蛋白翻译表达的鉴定,经鉴定感染后细胞可以高效表达细胞因子GM-CSF、IL4,感染后细胞的生长状态良好,能够长期在体外进行传代培养,可以用于DC诱导实验;丝裂霉素C(MMC)可以抑制细胞增殖,而不改变细胞分泌蛋白的性质,是体外常用的制备饲养层的方法之一,我们通过实验,最终确定了MMC的作用时间和浓度。采用免疫磁珠的方法从人外周血单核细胞(PBMC)中分离得到了高纯度的CD14+单核细胞,与建立的内皮细胞系进行共培养,通过表型及形态分析,最后得出结论本实验室建立的内皮细胞系可以诱导单核细胞分化为DCs,高表达T细胞共刺激分子和HLA-DR分子。本论文共分两部分:(1)建立共表达GM-CSF、IL-4的EA.hy926内皮细胞系;(2)GM-CSF、IL-4-EA.hy926细胞作为饲养层与外周血单核细胞共培养。主要研究结果如下:一、建立共表达GM-CSF、IL-4的EA.hy926内皮细胞系利用重叠PCR将GM-CSF、IL4基因通过剪切体T2A序列相连,得到GM-CSF-T2A-IL4融合基因。将融合基因构建入慢病毒表达载体pBPLV,得到重组的慢病毒表达载体。该重组慢病毒经双酶切、测序鉴定显示重组质粒构建成功。重组慢病毒载体及慢病毒包装质粒、包膜质粒共转染293FT细胞,转染24h后经荧光显微镜观察转染效率达到90%以上;浓缩后的病毒可以有效的感染内皮细胞系EA.hy926细胞,感染后的细胞经过扩大培养后感染效率依然可以达到94%,说明目的基因可以在感染细胞内稳定的传代;感染后细胞进行生长曲线的测定,其结果说明,感染后细胞的生长趋势没有减弱,能够很好的进行增殖;经实时定量PCR和ELISA方法证实感染后细胞hGM-CSF、hIL-4在mRNA水平的表达分别是未感染细胞的24倍和9946倍,在蛋白水平的表达分别是未感染细胞的145倍和23倍。二、GM-CSF、IL-4-EA.hy926细胞作为饲养层与外周血单核细胞共培养在丝裂霉素C(MMC)抑制内皮细胞系生长的实验中,确定了在处理时间为2.5h时,MMC的浓度选择为10μg/ml。在此浓度作用下,内皮细胞系生长受到抑制,但是保持其分泌的功能;利用磁珠分选CD14+单核细胞分选纯度达到94%以上,与以构建的内皮细胞系进行共培养后, CD14+单核细胞向DC方向分化,分化得到的DC表面有细小而密集的突起,流式细胞术检测DC表面的标志,结果显示此方法得到的DC表达CD1a,CD83,高表达DC特异性表面标志DC-SIGN,高表达共刺激分子CD40、CD80、CD86和HLA-DR。

全文目录

英文缩略词表  4-5
摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
前言  9-11
第一章建立共表达GM-CSF、IL-4的EA.hy926 内皮细胞系  11-32
  1. 材料  12-13
  2. 方法  13-22
  3. 结果  22-30
  4. 讨论  30-32
第二章 GM-CSF、IL-4-EA.hy926细胞作为饲养层与外周血单核细胞共培养  32-42
  1 材料  32-33
  2. 方法  33-35
  3. 结果  35-40
  4. 讨论  40-42
结论  42-43
参考文献  43-46
文献综述  46-53
  参考文献  50-53
个人简历  53-54
致谢  54

建立共表达GM-CSF、IL-4的EA.hy926内皮细胞系并诱导单核细胞向树突状细胞分化的研究

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