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慢病毒介导强制泛素化HBcAg基因修饰小鼠髓源性树突状细胞体外诱导细胞毒性T淋巴细胞反应

作　者: 陈建华
导　师: 汤正好
学　校: 苏州大学
专　业: 内科学
关键词: 乙肝病毒核心抗原泛素慢病毒树突状细胞细胞毒性T淋巴细胞
分类号: R512.62
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)的慢性感染仍然危害人类健康,全球大约有3.5亿人感染HBV,部分患者最终进展为肝硬化、肝细胞癌。目前尚无有效的方法彻底清除患者体内的乙肝病毒。特异性的细胞免疫反应在控制HBV的感染中起关键性作用,通过抗原刺激产生特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL)是清除慢性HBV感染者体内病毒的一个有效途径。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)是一种广泛存在于真核细胞内依赖ATP的高选择性蛋白质降解体系,它由泛素(ubiquitin, Ub)、泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme, E1)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme, E2)、泛素-蛋白连接酶(ubiquitin-protein ligase, E3)、26S蛋白酶体及去泛素化酶(deubiquitinating enzyme, DUB)等组成。泛素化的蛋白被蛋白酶体复合物识别后降解为若干小肽段,可以与MHCⅠ类分子结合被抗原提呈细胞识别,诱导特异性CTL反应。诸多研究表明,将泛素和抗原蛋白连接可显著促进抗原蛋白在细胞内的降解、递呈,增强抗原诱导的免疫应答。树突状细胞(dendritic cell, DC)是目前发现功能最强的抗原递呈细胞,它通过吞噬、表达、迁移等一系列过程,启动体内的免疫系统。已有研究表明,通过各种途径将DC负载病毒或肿瘤抗原,可促进抗原的加工提呈,有效激活抗原特异性CTL应答。本研究通过构建强制泛素化乙肝病毒核心抗原(Ub-HBcAg)重组慢病毒,体外转染小鼠骨髓源性DC,观察慢病毒(lentivirus, LV)介导的Ub-HBcAg基因修饰DC体外诱导抗原特异性的细胞免疫反应。本实验共分三部分:(1)Ub-HBcAg基因重组慢病毒(LV-Ub-HBcAg)的构建及其表达;(2)LV-Ub-HBcAg诱导小鼠髓源性树突状细胞成熟及在T淋巴细胞增殖中的作用;(3)LV-Ub-HBcAg修饰DC诱导CTL反应的体外研究。第一部分Ub-HBcAg基因重组慢病毒的构建及其表达目的构建Ub-HBcAg融合基因的慢病毒载体,包装成重组慢病毒并观察目的基因在293T细胞中的表达。方法PCR扩增Ub-HBcAg融合基因,插入到慢病毒骨架质粒pWPXLd中,构建成重组质粒pW-Ub-HBcAg。将重组的质粒pW-Ub-HBcAg和慢病毒包装质粒psPAX2、包膜质粒PMD2.G用脂质体共转染293T细胞,获得携带Ub-HBcAg基因的重组慢病毒LV-Ub-HBcAg,并通过Western blot检测目的基因在293T细胞中的表达。结果强制泛素化HBcAg融合基因的慢病毒载体经测序证实目的基因序列及插入方向均正确,荧光倒置显微镜观察到转染病毒细胞内绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)的表达,Western blot检测到目的蛋白在293T细胞中的表达。结论成功构建了携带强制泛素化HBcAg融合基因的慢病毒,转染293T细胞后能够稳定表达目的基因。第二部分LV-Ub-HBcAg诱导小鼠髓源性树突状细胞成熟及在T淋巴细胞增殖中的作用目的观察LV-Ub-HBcAg诱导体外培养的小鼠髓源性树突状细胞成熟及对T淋巴细胞增殖的作用。方法体外分离培养近交系Balb/c小鼠髓源性DC,加重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-simulating factor, GM-CSF),重组白细胞介素(interleukin, IL)-4培养5d,再加入LV-Ub-HBcAg,LV-HBcAg或LV诱导树突状细胞成熟,同时设阳性对照LPS组。流式细胞仪测定DC表面分子表达,ELISA法测定DC培养上清中IL-12的水平,Cell Counting Kit-8(CCK8)试剂盒检测T淋巴细胞增殖反应。两组间均数比较采用t检验。结果体外成功诱导培养小鼠髓源性DC,LV-Ub-HBcAg转染DC效率达56.1%,能明显上调DC表面分子CD80、CD86和MHC-II类分子表达,能促进DC分泌IL-12(128.08±15.09)pg/ml,且明显高于LV-HBcAg组分泌的量(P<0.01)。LV-Ub-HBcAg诱导DC刺激T细胞增殖能力显著高于LV-HBcAg组。结论LV-Ub-HBcAg能有效转染DC,促进DC分化、成熟,上调表面共刺激分子表达,增强DC刺激T细胞增殖及分泌IL-12能力。第三部分LV-Ub-HBcAg修饰DC诱导CTL反应的体外研究目的探讨慢病毒载体介导的Ub-HBcAg基因修饰DC体外诱导CTL反应。方法体外分离培养小鼠髓源性DC,加入重组慢病毒刺激DC成熟并与T淋巴细胞共培养,ELISA检测T淋巴细胞上清中IL-2、IL-4、IL-10和干扰素(interferon,IFN)-γ的分泌水平,流式细胞仪检测胞内细胞因子水平。结果LV-Ub-HBcAg刺激的DC能有效促进T淋巴细胞分泌细胞因子,其中IL-2 (436.5±44.6 pg/ml)和IFN-γ(144.6±15.6 pg/ml)明显高于LV-HBcAg组中IL-2(367.8±59.4 pg/m1)和IFN-γ(102.1±13.3 pg/m1)分泌。流式细胞仪检测LV-Ub-HBcAg诱导的CTL数量明显高于对照组。结论经Ub-HBcAg基因致敏的DC能有效刺激T淋巴细胞分泌Th1型细胞因子及增加CTL的表达。

全文目录

中文摘要  4-7
Abstract  7-11
英文缩写索引  11-12
引言  12-16
第一部分 Ub-HBcAg 基因慢病毒载体的构建及其表达  16-39
  前言  16
  材料与方法  16-27
  结果  27-35
  讨论  35-38
  小结  38-39
第二部分 LV-Ub-HBcAg 诱导小鼠髓源性树突状细胞成熟及在T 淋巴细胞增殖中的作用  39-50
  前言  39
  材料与方法  39-43
  结果  43-46
  讨论  46-49
  结论  49-50
第三部分 LV-Ub-HBcAg 修饰DC 诱导CTL 反应的体外研究  50-58
  前言  50
  材料与方法  50-52
  结果  52-54
  讨论  54-57
  结论  57-58
全文小结  58-59
参考文献  59-65
附录  65-73
攻读学位期间公开发表的论文  73-74
致谢  74-75

慢病毒介导强制泛素化HBcAg基因修饰小鼠髓源性树突状细胞体外诱导细胞毒性T淋巴细胞反应

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