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小鼠肝实质细胞蛋白质表达谱构建及功能分析

作　者: 刘伟
导　师: 贺福初; 姜颖
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 肝脏细胞蛋白质组 mRNA和蛋白质表达的相关性细胞特异性功能注释
分类号: R329
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

肝脏是人体内最大的腺体，其主要功能包括物质代谢、解毒、防御、激素系统稳态、血液存储和pH调节、造血和免疫调节等。肝脏由肝实质细胞、肝窦内皮细胞、枯否细胞和星状细胞等组成。细胞是肝脏复杂功能发挥的基础，尽管对于这些细胞的研究不少，其蛋白质组成并不清楚，在细胞水平的肝脏蛋白质组构建还没有进行。随着高精度质谱仪的发展，高通量规模化鉴定真核细胞的蛋白质组成为可能。利用生物信息学方法进行蛋白质鉴定和数据挖掘，全面系统地描绘细胞表达的蛋白，对理解不同类型细胞的特异功能具有重大意义。基于细胞的蛋白质组研究是蛋白质组学研究内容之一，也是人类肝脏蛋白质组计划（human liver proteome project，HLPP）的重要组成部分。本研究欲分离和纯化小鼠肝脏的不同细胞，同时构建不同细胞的蛋白质表达谱。对肝脏内的主要细胞类型-肝实质细胞蛋白质数据集进行了深入的挖掘，分析其功能特征。本研究通过系统生物学的方法对肝脏细胞蛋白质组和转录组进行比较分析，发现一批和肝脏细胞功能特异性相关的分子。通过比较细胞膜表面表达的CD分子，以寻找细胞特异性的表面标记物。同时，对这些细胞参与的KEGG通路进行比较，发现丙酮酸代谢通路可能存在实质细胞和非实质细胞细胞间协作，这对于理解肝脏细胞在代谢中的相互协作起重要提示作用。另外，选取通路中的多个分子进行验证，为我们的假说提供实验证据。细胞预分离方法提高了肝脏蛋白质组的覆盖率，新鉴定出许多以前在肝脏中没有鉴定出来的蛋白，而其中的一些蛋白质缺失功能信息，本研究通过3种方法对这些蛋白质进行了功能注释。首先，通过2步原位灌流结合密度梯度和免疫磁珠分选（magnetic activated cell sorting，MACS）方法对肝脏细胞进行分离纯化，通过细胞学方法和免疫印迹评价细胞纯度，建立了细胞制备方法，为后续实验获得足够数量和纯度的细胞，用于蛋白质组表达谱构建。我们以C57BL/6J小鼠肝脏为材料，建立了一套从同一组织中同时获取肝实质细胞、肝窦内皮细胞、库否细胞和星状细胞4种细胞的方法。第二，构建基于SDS-PAGE联合胶内酶切和LTQ-FT质谱鉴定流程的无标记定量方法。通过筛选，选择牛血清白蛋白作为内参蛋白。以复杂样本作为背景，研究蛋白上样量和质谱相应信号关系。发现在一定范围内，蛋白上样量和质谱响应信号成线性关系，成功建立了复杂样本适用的蛋白质组无标定量体系。用APEX软件（absolute protein expressionmeasurements）对质谱数据进行定量。该软件利用校正的谱图计数对鉴定蛋白进行相对定量，用机器学习算法校正不同实验批次间误差和肽段理化性质不同引起的离子化效率差异，能够较为精确测量出蛋白质在不同细胞内的相对表达值。在95%置信度和双肽段鉴定的数据标准下，肝脏实质细胞中共鉴定到8,060个蛋白质，其中4,842个蛋白质有定量信息。第三，对鉴定肝实质细胞蛋白质的理化性质和丰度分布进行分析，发现代谢酶在肝实质细胞中占很大比重，提示其活跃的代谢能力。结合文献和GO（Gene Ontology）注释信息，对细胞中具有重要生理功能的亚蛋白质组进行分析，包括CYP450蛋白家族（cytochromeP450）、糖原结合蛋白、细胞极性相关蛋白和激酶，其中4个CYP450蛋白和9个细胞极性相关蛋白为首次在肝脏中鉴定到的蛋白。同时，结合蛋白质相互作用网络进行分析，发现这些亚蛋白质组可能参与的生物学功能。通过和小鼠血浆蛋白质组数据比较，发现一些在肝实质细胞中高表达，而在血浆中低表达的蛋白，这些蛋白质可能作为肝脏损伤的血清候选标记物。结合mRNA表达和蛋白质丰度信息，分析不同功能类别蛋白表达模式，发现维持细胞生存的核心功能基因其mRNA和蛋白质表达丰度的相关性较高，调控功能相关的基因其mRNA和蛋白质表达丰度的相关性普遍低。转氨酶、核糖体和染色体蛋白质其mRNA和蛋白质表达的丰度没有相关性。第四，肝脏细胞蛋白质组和转录组数据进行比较，发现细胞的特异功能特点。通过聚类分析、GO分析和KEGG通路分析，发现肝脏实质细胞主导物质和能量代谢、肝窦内皮主导物质交换、库否细胞主导免疫以及星状细胞主导细胞外基质组成。通过哺乳动物表型数据库（mammalian phenotype ontology，MPO）分析，发现4种细胞在不同肝病中发挥不同作用，这和细胞各自的特异功能特点是相关的。同时，对鉴定到的细胞表面CD分子进行比较，发现一批和细胞特异功能相关的分子，这些分子可能作为肝脏细胞新的细胞膜表面标记物，值得后续验证。第五，利用3种最新的功能注释算法Blast2GO、权重基因共表达分析（weighted geneco-expression analysis，WGCNA）和Endeavour，分别基于蛋白质序列、基因表达和公共数据库整合打分等3种方法，注释了实质细胞中的2,944个功能未知蛋白的功能。其中数目比较多的有82个膜整合蛋白、59个细胞核蛋白、40个胞浆蛋白和35个线粒体蛋白。为整合利用多种数据资源和算法进行蛋白功能注释做了初步探索。最后，在通路水平分析通路成员在不同细胞中表达情况，筛选出丙酮酸代谢通路可能在不同细胞间存在协作，对该通路中的候选分子进行WB验证。另外，还选取一些表达具有细胞特异性的分子进行验证。发现APOA4为肝实质细胞特异表达，ACYP1、ACYP2、ME2为非实质细胞特异表达，DOK2、IFNGR1为肝实质细胞和库否细胞特异表达，COLEC10主要在肝实质细胞和星状细胞表达。结合他人报道的转录组数据，进一步说明了这些分子表达的细胞特异性。这些细胞特异marker分子可能反映了其特异的功能，同时为相关肝病发生的机制研究提供细胞信息。

全文目录

缩略词对照  5-6
摘要  6-8
Abstract  8-10
第一章绪论  10-26
  1 研究背景  10-23
    1.1 蛋白质组学：大规模研究蛋白质功能的科学  10-20
    1.2 基于细胞的肝脏图谱  20-22
    1.3 应用组学技术研究肝脏细胞的现状  22-23
  2 研究内容和创新点  23-24
  3 论文结构  24-26
第二章小鼠肝细胞分离纯化及纯度评价  26-34
  1 材料与方法  26-30
  2 结果  30-32
    2.1 HC、HSC、LSEC 和 KC 的特征、纯度和得率  30-32
  3 讨论  32-34
第三章蛋白质组非标记定量研究策略的评估及蛋白质表达谱构建  34-42
  1 材料与方法  34-37
  2 结果  37-39
    2.1 APEX 非标记定量策略的可重复性和准确性评估  37-39
    2.2 标准蛋白校正效果分析  39
    2.3 小鼠肝脏细胞蛋白质鉴定概况  39
  3 讨论  39-42
第四章肝脏实质细胞蛋白质表达谱数据分析及相关验证  42-72
  1 材料与方法  42-45
  2 结果  45-66
    2.1 肝细胞蛋白质组数据分析  45-66
      2.1.1 HC 鉴定蛋白的偏性分析  45-46
      2.1.2 HC 蛋白质鉴定概况  46-49
      2.1.3 HC 蛋白质组的功能分类  49-52
      2.1.4 HC 蛋白质组与全肝蛋白质组的比较  52
      2.1.5 HC 转录组与肝脏转录组的比较  52-54
      2.1.6 HC 蛋白质组与转录组的比较  54-55
      2.1.7 HC 蛋白质组与血浆蛋白质组的比较  55-56
      2.1.8 HC 蛋白质组与其他细胞蛋白质组的比较  56-57
      2.1.9 肝脏细胞膜蛋白的比较  57-59
      2.1.10 转录因子在肝脏细胞中的表达  59
      2.1.11 小鼠肝脏细胞表型分析  59-60
      2.1.12 三种方法对功能不明确蛋白进行注释  60-63
      2.1.13 肝实质细胞特异的功能模块分析  63-64
      2.1.14 肝脏不同类型细胞通路表达差异分析  64-65
      2.1.15 侯选通路分子的验证  65-66
  3 讨论  66-72
    3.1 肝脏细胞的纯度评估  66
    3.2 大规模质谱数据中低丰度蛋白的鉴定  66-68
    3.3 蛋白质分类和蛋白质丰度的关系  68-69
    3.4 HC 功能特性  69
    3.5 不同细胞类型在代谢通路间的协作关系  69-72
第五章结论与展望  72-76
  1 总结  72-73
  2 展望  73-76
参考文献  76-85
附录 1 WGCNA 分析获得的小鼠肝脏基因共表达模块的特征  85-87
附录 2 在不同肝脏细胞中鉴定到的细胞特异 CD 分子  87-89
附录 3 肝脏不同细胞表达的转录因子  89-92
综述  92-103
个人简历  103-104
致谢  104

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