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陆地棉细胞质雄性不育及其恢复机制的研究

作　者: 徐奇
导　师: 刘康
学　校: 南京农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 棉花 细胞质雄性不育(CMS) 线粒体 cDNA-AFLP 蛋白质组学
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


植物细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)是一种不能产生有活力花粉的遗传现象,在植物杂种优势利用中具有重要价值。棉花细胞质雄性由于不育机理尚不清楚,恢复基因也未得到克隆等原因,同玉米、水稻等作物雄性不育研究相比,要远远落后。因此,开展棉花细胞质雄性不育的分子机理研究,便于更好的利用棉花杂种优势,具有重要的理论和实践意义。哈克尼西棉(Gossypium harknessii Brandegee)细胞质雄性不育是由细胞质基因控制的并可被核恢复基因抑制的性状,其花药在造抱细胞增殖期就开始退化,并在花粉母细胞减数分裂时期达败育高峰,进而花粉母细胞不能形成四分体,是一种无花粉粒的雄性不育。这种雄性细胞退化早、败育过程清晰和凋亡彻底的花药,既是杂交棉制种的有利条件,也是雄性不育机理研究的良好材料。为此,本文以细胞质来自哈克尼西棉的陆地棉细胞质雄性不育系104-7A和保持系中棉所12、恢复系02-613-2R、F1 (104-7Ax02-613-2R)花药为材料,通过cDNA-AFLP以及线粒体差异蛋白质组学的分析,鉴定与棉花细胞质雄性不育及恢复相关的基因与蛋白,并探讨细胞质雄性不育及恢复产生的可能机理。研究主要结果如下：1.分别利用蔗糖、Percoll和Nycdenze密度梯度离心分离棉花花药线粒体。通过线粒体标志酶活力测定和透射电镜观测鉴定线粒体的纯度和完整性,最终建立一套以蔗糖为介质的密度梯度离心,从包括冷冻花药等各种棉花组织中分离高纯度的完整线粒体的方法。2.利用cDNA-AFLP技术,分析了棉花胞质雄性不育系、保持系、恢复系和F1开花前8天花药的基因表达谱及其差异,结果表明：不育系花药的基因表达谱与其“同核异质”的保持系之间存在着巨大的差异,提示细胞质基因对细胞核基因的表达有调控作用。恢复基因引入到不育系获得F1,其花药的基因表达谱与正常可育花药相似,与恢复系基本相同,核内恢复基因可以反作用于细胞质不育基因对核基因表达的调控机制,恢复花粉的育性。CMS基因对核基因表达的调控作用以及恢复基因对这种作用的逆转可能是棉花细胞质雄性不育及其恢复的重要原因。另外,我们还鉴定了36个在恢复系和F1优势表达而在不育系和保持系中不表达或者微量表达的cDNA扩增片段,为恢复相关基因的克隆奠定了基础。3.应用2-DE和质谱鉴定为基础的差异蛋白质组学技术,分别研究了CMS不育系与可育系的线粒体蛋白质差异表达,以及CMS不育系与恢复系的线粒体蛋白质差异。经PDQuest软件分析,我们共获得了46个与育性相关的蛋白和1个与恢复相关的蛋白,通过MALDI-TOF-TOF MS串联质谱分析,成功鉴定了34个与育性相关蛋白和1个与恢复相关蛋白。育性相关的34个蛋白,经数据库搜索,划分为5类,分别为：能量代谢相关蛋白、蛋白质加工相关蛋白、激素合成相关蛋白、缓解细胞毒素相关蛋白和其他蛋白。它们从蛋白质水平上证明了棉花细胞质雄性不育主要与能量代谢、蛋白质加工、ABA合成、活性氧等有关。ATP酶是生物体能量代谢中的一个重要的酶。与CMS恢复相关蛋白经鉴定为ATP合酶p亚基。所以,我们推测在恢复系中存在的ATP合酶β亚基通过调节ATP酶的活性,对不育系线粒体的能量代谢起恢复作用,从而恢复了花粉的育性。

全文目录


摘要  7-9ABSTRACT  9-11第一部分 文献综述  11-43  第一章 细胞质雄性不育与恢复基因研究进展  11-29    1 植物细胞质雄性不育研究进展  11-16      1.1 细胞质雄性不育的类型  11-12      1.2 细胞质雄性不育与细胞质遗传系统  12-15      1.3 细胞质雄性不育的发育调控机理假说  15-16    2 植物细胞质雄性不育育性恢复基因研究进展  16-20    3 棉花细胞质雄性不育研究进展  20-21    4 PPR基因家族的研究进展  21-29      4.1 PPR基因家族的结构特点  21-22      4.2 PPR基因家族在染色体上的分布及其在不同生物中的数量  22-23      4.3 PPR蛋白的功能  23-29  第二章 蛋白质组学研究进展  29-41    1 双向电泳技术  29-31    2 质谱技术  31-33    3 蛋白质组生物信息学  33    4 蛋白质组学发展趋势  33-34    5 亚细胞蛋白质组学研究进展  34-37    6 线粒体蛋白质组学研究  37-38    7 蛋白质组学在细胞质雄性不育研究方面的应用  38-41  本研究的目的意义  41-43第二部分 研究报告  43-87  第三章 棉花细胞质雄性不育与恢复特性的cDNA-AFLP分析  43-51    1 材料与方法  43-45      1.1 材料  43-44      1.2 方法  44-45        1.2.1 RNA提取  44        1.2.2 双链cDNA合成  44        1.2.3 AFLP-PCR  44        1.2.4 电泳  44-45        1.2.5 聚类分析  45    2 结果与分析  45-49      2.1 棉花花药RNA提取方法  45-46      2.2 不育系、保持系、恢复系、F1花药基因表达谱的比较分析  46-47      2.3 不育基因对核基因表达的影响  47      2.4 恢复相关基因的初步筛选  47-49    3 讨论  49-51  第四章 棉花线粒体分离及鉴定方法的研究  51-59    1 材料与方法  51-54      1.1 植物材料  51      1.2 实验方法  51-54        1.2.1 棉花黄化苗的培养  51        1.2.2 Percoll密度梯度离心  51-52        1.2.3 Nycdenze密度梯度离心  52        1.2.4 蔗糖密度梯度离心  52        1.2.5 蛋白质浓度的测定  52-53        1.2.6 琥珀酸脱氢酶活力测定  53        1.2.7 过氧化氢酶活力测定  53        1.2.8 电镜样品制备及透射电镜观察  53-54    2 结果与分析  54-58      2.1 三种不同提取方法的比较  54-55      2.2 线粒体鉴定  55-58    3 讨论  58-59  第五章 棉花线粒体蛋白质的提取及双向电泳技术的研究  59-69    1 材料与方法  59-62      1.1 植物材料  59      1.2 试验方法  59-62        1.2.1 蛋白质提取方法  59-60        1.2.2 蛋白质溶解  60        1.2.3 蛋白质定量  60        1.2.4 IEF  60-61        1.2.5 SDS-PAGE电泳  61        1.2.6 聚丙烯酰胺胶染色  61        1.2.7 图像扫描与分析  61-62    2 结果与分析  62-68      2.1 四种方法提取蛋白质的2-DE胶图谱比较  62-65      2.2 IEF不同上样方法对棉花蛋白质的2-DE的影响  65-66      2.3 两种染色方法的效果比较  66-68    3 讨论  68-69  第六章 棉花细胞质雄性不育与恢复的蛋白质组学研究  69-87    1 材料与方法  69-71      1.1 植物材料  69      1.2 实验方法  69-71        1.2.1 蛋白提取及双向电泳  69-70        1.2.2 聚丙烯酰胺胶的染色  70        1.2.3 2-DE胶分析  70        1.2.4 挖点与脱色  70        1.2.5 酶解与肽段提取  70        1.2.6 质谱分析  70        1.2.7 数据库搜索与生物信息学分析  70-71    2 结果与分析  71-81      2.1 CMS育性相关的线粒体蛋白质的分析及鉴定  73-80        2.1.1 CMS育性相关线粒体蛋白的差异分析  73-74        2.1.2 CMS育性相关线粒体蛋白的质谱鉴定  74-80      2.2 与CMS恢复相关线粒体蛋白质的分析及鉴定  80-81        2.2.1 CMS恢复相关线粒体蛋白质的差异表达及质谱鉴定  80-81        2.2.2 CMS恢复相关线粒体蛋白质的功能分析  81    3 讨论  81-87第三部分:全文总结  87-89参考文献  89-101致谢  101-103在读期间发表的论文  103

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 纤维作物 > 棉
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