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缺血后处理在大鼠心肌线粒体比较蛋白质组学的研究

作　者: 黄建廷
导　师: 喻田；刘兴奎
学　校: 遵义医学院
专　业: 麻醉学
关键词: 缺血后处理线粒体蛋白质组学 2D-DIGE 质谱分析心肌保护
分类号: R614
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：建立大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,观察缺血后处理对缺血再灌注损伤大鼠心脏功能的影响；分离纯化心肌线粒体并提取线粒体蛋白行2D-DIGE比较蛋白质组学分析与鉴定,探讨缺血后处理方式对心肌线粒体蛋白表达的影响。方法：1.将SD大鼠随机分为正常组(Nor)、缺血再灌注损伤组(Con)、缺血后处理组(IPO)、5-羟葵酸拮抗缺血后处理组(5-HD+IPO),每组6只。采用Langendorff灌注装置建立各组大鼠离体心脏模型,各组均先灌注K-H液平衡20min。Nor组：续灌K-H液100min; Con组：灌注4℃ST.Thomas停跳液后缺血40min,复灌K-H液60min；IPO组：灌注4℃ST.Thomas停跳液后缺血40min,于复灌开始前予以复灌K-H液10s、停灌10s的循环6次,续灌K-H液58min; 5-HD+IPO组：灌注4℃ST.Thomas停跳液后缺血40min,行5-羟葵酸灌注5min,继以K-H液复灌10s、停灌10s循环6次,续灌K-H液53min。观察并记录各组平衡末和续灌末心率(HR)、左室发展压(LVDP)、左室舒张末压(LVDEP)、以及最大dp/dt等心功能的变化。2.以差速离心法及Nycodenz密度梯度离心法提取、纯化大鼠心肌线粒体,并以Western blot法验证其纯度。3.按照2中方法获取纯化的心肌线粒体；提取各组线粒体蛋白并行纯化后定量；采用Cydye染料对各组荧光标记后行2D-DIGE分离。采用DeCyder V6.0软件分析对比组差异表达蛋白点并将差异蛋白质斑点进行全自动斑点处理工作站处理；最后进行MALDI-TOF-MS鉴定和数据检索。结果：1.平衡末各组间心功能无明显差异；续灌末Nor, IPO组心功能显著优于Con组,5-HD+IPO组与Con组比较心功能无明显差异。2.采用Nycodenz不连续密度梯度离心法提纯了大鼠心肌线粒体,并以Western blot法证实了所获线粒体纯度较高。3.对各组进行2D-DIGE,得到聚焦良好、相似性高的图谱,在各组胶上平均检测出752±49个蛋白斑点；各组分析鉴定后得到28个较好的差异蛋白点图谱,本研究重点关注其中差异1.5倍以上的5个蛋白。4.(1)Nor和Con组比较鉴定出：spot554 (NDUFA10, NADH dehydrogenase [ubiquinone] 1 alpha subcomplex subunit 10, mitochondrial; NADH脱氢酶亚基)表达水平降低3.84倍；spot555 (rCG55630,isoform CRA,推测为NADH脱氢酶亚基)表达水平降低3.76倍。(2)IPO和Con组比较鉴定出：spot554(NDUFA10)、spot254(SDHA, Succinate dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein subunit, mitochondrial;琥珀酸脱氢酶—黄素蛋白)两种蛋白表达水平显著分别降低3.33倍、1.68倍；spot645 (CoQ9,合成CoQ的必须酶)表达水平降低3.43倍、spot648 (CoQ9)表达水平升高2.42倍。(3) 5-HD+IPO和IPO组比较鉴定出：spot254 (SDHA)表达水平升高1.65倍。结论：1.缺血后处理能改善大鼠心脏功能；而5-羟葵酸拮抗缺血后处理能抑制缺血后处理改善心功能的作用。2. Nycodenz不连续密度梯度离心法可获得纯度较高心肌线粒体。3.(1)心肌缺血再灌注损伤影响NDUFA10的活性。(2)缺血后处理可维持线粒体NADH呼吸链稳定。(3) SDHA和线粒体敏感性K+通道(mitoKATP)存在着密切的关系；两者相互作用共同参与了缺血后处理内源性保护机制。(4)缺血后处理用于缺血再灌注心肌时可能造成CoQ9发生剪切或修饰。

缺血后处理在大鼠心肌线粒体比较蛋白质组学的研究

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