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牛病毒性腹泻病毒E0基因的表达及间接ELISA检测方法的建立

作　者: 王璐
导　师: 冉多良
学　校: 新疆农业大学
专　业: 预防兽医
关键词: 牛病毒性腹泻病毒 E0基因 原核表达 间接ELISA方法
分类号: S858.23
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


牛病毒性腹泻粘膜病是牛的一种接触性传染病,此病可以感染各个年龄段的牛,在全世界广泛分布。该病能引起患畜高热、口腔及鼻内粘膜出血或产生大量粘液、母牛奶量减少甚至停止产奶、怀孕母牛流产或产死胎、畸形胎等症状。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)与猪瘟病毒和羊边界病毒在血清学上有交叉反应。在BVDV的结构蛋白中,E0基因保守性较高,并且具备一定的免疫原性,因此可作为基因工程的诊断抗原或用于研究基因工程亚单位疫苗。本研究根据已发表的BVDV-EO基因序列设计一对特异性引物。将OregonC24V标准毒接种于MDBK细胞中增殖并收集病毒液,从病毒液中提取RNA。以RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增出了921bp的E0基因。之后构建pMD18-T-E0克隆载体,经PCR扩增和酶切鉴定后进行测序。随后利用含有表达E0蛋白的重组质粒pET28a-E0转化至表达菌BL21(DE3)中,经培养诱导表达出重组E0蛋白,经Western blot显示,纯化后的的重组E0蛋白的分子量大小为34kD左右,能与BVDV阳性血清反应,具有生物学活性。用纯化后的E0蛋白作为包被抗原,经试验确定最佳抗原包被浓度为1.23μg/孔,血清最佳稀释度为1：160。特异性试验与重复性试验的结果表明,所建立的间接ELISA检测方法特异性较好,变异性也较小。与商品化BVDV抗体检测试剂盒相比,所建立的ELISA检测方法的敏感性为88.5%,特异性为82.1%,说明该间接ELISA方法具有较小的误差。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-9
第1章 前言  9-22
  1.1 BVDV简介  9
  1.2 BVDV生物学特性  9-12
    1.2.1 BVDV的理化性质  10
    1.2.2 BVDV的分型  10-11
    1.2.3 BVDV的结构蛋白研究进展  11-12
  1.3 BVDV流行病学研究进展及持续性感染  12-15
    1.3.1 国外BVD流行现况  13-14
    1.3.2 国内BVD流行现况  14-15
    1.3.3 持续性感染  15
  1.4 BVDV检测方法研究进展  15-19
    1.4.1 病毒分离  16
    1.4.2 电镜技术  16-17
    1.4.3 琼脂扩散试验  17
    1.4.4 病毒中和试验  17
    1.4.5 酶联免疫吸附试验  17-18
    1.4.6 免疫荧光技术  18
    1.4.7 反转录-多聚链式反应(RT-PCR)技术  18-19
  1.5 BVD的防治  19-20
  1.6 研究目的和意义  20-22
第2章 BVDV-E0基因原核表达载体的构建及表达  22-40
  2.1 实验材料  22-24
    2.1.1 细胞、病毒株、质粒及菌种  22
    2.1.2 血清及抗体  22
    2.1.3 主要试剂  22-23
    2.1.4 主要仪器  23
    2.1.5 引物  23-24
  2.2 实验方法  24-33
    2.2.1 牛肾细胞的制备及BVDV-C_(24)V的增殖  24
    2.2.2 BVDV-E0基因的克隆及序列分析  24-29
    2.2.3 BVDV-E0基因原核表达载体的构建  29-30
    2.2.4 阳性重组质粒pET-28a-E0的表达与纯化  30-33
  2.3 实验结果  33-38
    2.3.1 细胞培养及C_(24)V毒株增殖结果  33-34
    2.3.2 BVDV-E0基因RT-PCR的结果  34
    2.3.3 重组质粒pMD18-T-E0的鉴定与测序结果分析  34-35
    2.3.4 pET-28a-E0原核表达载体的鉴定  35
    2.3.5 重组质粒pET-28a-E0表达产物的SDS-PAGE  35-36
    2.3.6 目的蛋白的纯化  36-38
    2.3.7 目的蛋白的Western blot  38
  2.4 讨论  38-40
    2.4.1 细胞培养与病毒增殖  38-39
    2.4.2 RNA的提取  39-40
第3章 间接ELISA方法的建立  40-51
  3.1 间接ELISA反应条件的优化  40-41
    3.1.1 抗原包被最佳浓度与血清最佳稀释度的选择  40
    3.1.2 最佳封闭液及封闭时间的确定  40-41
    3.1.3 血清最适作用时间的测定  41
    3.1.4 酶标二抗最佳工作浓度及工作时间的测定  41
    3.1.5 底物工作时间的测定  41
  3.2 阴阳性临界值的确定  41-42
  3.3 敏感性试验  42
  3.4 特异性试验  42
  3.5 重复性试验  42-43
    3.5.1 批内重复  42
    3.5.2 批间重复  42-43
  3.6 与商品化试剂盒的比较试验  43
  3.7 实验结果  43-49
    3.7.1 抗原包被最佳浓度与血清最佳稀释度的确定  43-44
    3.7.2 最佳封闭液及封闭时间的确定  44-45
    3.7.3 血清最适作用时间的确定  45
    3.7.4 酶标二抗最佳工作浓度及工作时间的测定  45
    3.7.5 底物工作时间的测定  45-46
    3.7.6 阴阳性临界值的确定  46
    3.7.8 特异性试验  46-47
    3.7.9 敏感性试验  47
    3.7.10 重复性试验  47-49
    3.7.11 与商品化试剂盒的比较试验  49
  3.8 讨论  49-51
第4章 结论  51-52
参考文献  52-58
致谢  58-59
作者简介  59

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 各种家畜、家禽、野生动物的疾 > 家畜 > 牛
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