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胡萝卜软腐果胶杆菌致病相关基因的功能分析

作　者: 李婷
导　师: 范加勤
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 胡萝卜软腐果胶杆菌 clpP hsl aspA ugpB基因 同源重组 致病性
分类号: S436.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 8次
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内容摘要


胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum,以下简称Pcc)是引起彩色马蹄莲细菌性软腐病的重要病原菌,并且寄主广泛,危害严重。实验室前期用Pcc与黄花马蹄莲(Zantedeschia elliotiana)组织离体互作,应用双向电泳技术(2-DE)和质谱技术,进行差异表达蛋白分析发现有70个蛋白点与未互作的野生型存在表达差异,其中包括ClpP蛋白、HSP33蛋白、天冬氨酸转氨酶(aspartate ammonia-lyase)和3-磷酸甘油转运相关蛋白(glycerol-3-phosphate transporter periplasmic binding protein),相应的编码基因为clpP, hsl, aspA, ugpB。为了阐明clpP, hsl, aspA, ugpB对Pcc在致病性等方面的影响。在本研究中,我们克隆了clpP, hsl, aspA, ugpB基因,用同源重组的方法构建相应基因的缺失突变株,明确了这四个基因对Pcc在运动性,致病性和生长能力等方面的影响,以此来推知基因的功能,为深入认识clpP, hsl, aspA, ugpB对Pcc的调控提供了科学依据。(一)采用PCR的方法从Pcc基因组中克隆到clpP基因,用同源重组法构建定向缺失突变体△clpP, PCR和Southern杂交结果显示,clpP基因被成功敲除。测定突变体及其互补菌株的菌体形态、运动性、致病相关胞外酶活、生物膜形成、生长能力、定殖能力及致病性等表型。研究后发现：(1)与野生型相比,△clpP的游动能力不变；(2)生物膜形成能力降低；(3)蛋白酶,纤维素酶和果胶酶酶活均有不同程度的降低,并用qRT-PCR从转录水平进行验证；(4)应激能力下降,与野生型相比,△clpP的耐高温和营养饥渴能力、抗氧化压力均下降；(5)△clpP定殖能力明显低于野生型菌株；(6)接种寄主叶片,致病性几乎丧失。基因互补可使上述表型恢复。试验表明：clpP基因是Pcc致病所必需的,其突变可使细菌丧失致病性。(二)采用PCR的方法从Pcc基因组中克隆到hsl, aspA, ugpB基因,用同源重组法构建定向缺失突变体△hsl,△aspA,△ugpB, PCR结果显示,hsl, asp A, ugpB基因被成功敲除,并构建了相应基因的过表达菌株。测定突变体运动性、致病相关胞外酶活、生物膜形成、生长能力、及致病性等表型。研究后发现：△hsl,△aspA,△ugpB的各个表型均与野生型无明显差别,接种寄主叶片后,致病性也未丧失或降低。试验表明：hsl, asp A, ugpB基因与Pcc致病不相关。

全文目录


摘要  8-9
ABSTRACT  9-11
上篇 文献综述  11-29
  第一章 彩色马蹄莲细菌性软腐病的研究进展  12-24
    1 彩色马蹄莲细菌性软腐病的概述  12-13
      1.1 病原  12-13
      1.2 病害症状  13
      1.3 病原菌的传播  13
    2 病原菌的致病过程  13-14
    3 彩色马蹄莲细菌性软腐病的防治  14-16
      3.1 农业防治  14-15
      3.2 选种无病材料  15
      3.3 选育抗性品种  15-16
      3.4 化学防治  16
      3.5 生物防治  16
    4 病原菌的致病机理  16-24
      4.1 病原菌的致病因子  17-19
      4.2 黏附素和生物膜的形成  19
      4.3 胞外多糖和脂多糖  19-21
      4.4 游动性  21
      4.5 对活性氧的抗性  21-22
      4.6 植物毒素  22
      4.7 hrp基因  22-24
  第二章 Clp蛋白酶的研究进展  24-29
    1 各种生物的Clp蛋白  24-25
    2 Clp蛋白酶的结构  25-26
    3 Clp蛋白酶的作用机制  26
    4 Clp蛋白酶生物学功能  26-29
      4.1 Clp蛋白酶控制胞内蛋白质的质量  27-28
      4.2 Clp蛋白可影响细菌的毒力  28-29
下篇 研究内容  29-76
  第一章 胡萝卜软腐果胶杆菌中clpP基因的功能分析  30-62
    摘要  30-31
    1 试验材料  31-34
      1.1 供试菌株和质粒  31-32
      1.2 培养基及抗生素  32-33
      1.3 引物  33-34
    2 试验方法  34-48
      2.1 质粒的提取  34-35
      2.2 细菌基因组DNA的大量提取  35-36
      2.3 DNA凝胶电泳及DNA片段浓度、大小测算  36
      2.4 DNA酶切、连接和PCR产物回收  36
      2.5 质粒DNA的转化  36-37
      2.6 Southern杂交  37-41
      2.7 clpP缺失突变体的构建  41-43
      2.8 互补菌株的构建及验证  43
      2.9 细胞形态和鞭毛观察  43
      2.10 游动性试验  43
      2.11 细菌沉降性试验  43-44
      2.12 胞外酶的检测  44
      2.13 生物膜的检测  44-45
      2.14 生长曲线测定  45
      2.15 突变体抗氧化压力测定  45
      2.16 致病性和过敏性反应测定  45-46
      2.17 体内定殖能力测定  46
      2.18 总RNA的提取及qRT-PCR检测  46-48
    3 结果与分析  48-60
      3.1 clpP上下游片段基因的克隆  48
      3.2 clpP突变株的构建  48-50
      3.3 互补菌株的构建  50-51
      3.4 clpP基因突变不影响PccS1鞭毛合成和运动性  51-52
      3.5 clpP基因突变后不产生沉降现象  52
      3.6 clpP基因突变后影响胞外蛋白酶、果胶酶和纤维素酶的产生  52-53
      3.7 clpP基因突变降低了生物膜的产生  53-54
      3.8 不同培养基上clpP基因的突变影响PccS1正常生长  54-55
      3.9 随着温度升高clpP基因的突变影响PccS1正常生长  55-56
      3.10 clpP基因突变降低PccS1抗氧化压力能力  56
      3.11 clpP基因突变影响PccS1致病性,但不影响过敏性反应  56-58
      3.12 clpP基因突变影响菌株在大白菜体内增殖能力  58-59
      3.13 qRT-PCR检测结果  59-60
    4 讨论与结论  60-62
  第二章 胡萝卜软腐果胶杆菌中aspA、hsl和ugpB基因的功能分析  62-76
    摘要  62-63
    1 试验材料  63-65
      1.1 供试菌株和质粒  63-64
      1.2 培养基及抗生素  64-65
      1.3 引物  65
    2 试验方法  65-68
      2.1 质粒的提取  65-66
      2.2 细菌基因组DNA的提取  66
      2.3 DNA凝胶电泳及DNA片段浓度、大小测算  66
      2.4 DNA酶切、连接和PCR产物回收  66
      2.5 质粒DNA的转化  66
      2.6 缺失突变体的构建  66-67
      2.7 过表达菌株的构建及验证  67
      2.8 游动性试验  67
      2.9 细菌沉降性试验  67-68
      2.10 胞外酶的检测  68
      2.11 生物膜的检测  68
      2.12 生长曲线测定  68
      2.13 致病性的测定  68
    3 结果与分析  68-73
      3.1 aspA、hsl和ugpB基因的克隆  68-69
      3.2 aspA、hsl和ugpB基因突变株的构建  69-70
      3.3 aspA、hsl和ugpB基因过表达菌株的构建  70
      3.4 aspA、hsl和ugpB基因突变不影响PccS1的游动性  70-71
      3.5 aspA、hsl和ugpB基因突变后不产生沉降现象  71
      3.6 aspA、hsl和ugpB基因突变后不影响胞外酶的产生  71-72
      3.7 aspA、hsl和ugpB基因与生物膜的形成无关  72
      3.8 aspA、hsl和ugpB基因突变不影响PccS1生长能力  72-73
      3.9 aspA、hsl和ugpB基因突变不影响PccS1致病性  73
    4 讨论与结论  73-76
      4.1 aspA基因与胡萝卜软腐果胶杆菌致病性不相关  74
      4.2 hsl基因与胡萝卜软腐果胶杆菌致病性不相关  74
      4.3 ugpB基因与胡萝卜软腐果胶杆菌致病性不相关  74-76
全文总结  76-78
参考文献  78-86
攻读学位期间发表的学术论文  86-88
致谢  88

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 蔬菜病虫害 > 根菜类病虫害
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