学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸—糖磷酸转移酶系统（PTS系统）分子改造及敲除菌性能测定

作　者: 周军智
导　师: 蔡亚非
学　校: 安徽师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: Red同源重组 PTS系统 ptsHIcrr操纵子 大肠杆菌
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 151次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶系统（简称PTS系统）在葡萄糖磷酸化和转运过程中起重要作用,利用I-SceⅠ介导的Red同源重组技术敲除大肠杆菌ptsG基因和ptsHIcrr操纵子,考察缺陷株生长性能及其可能的应用。通过重叠PCR构建含有待敲除基因上下游同源臂及两端含有18bp特异序列的打靶片段,酶切连接等得到高拷贝打靶质粒,打靶质粒和辅助质粒经电转化至宿主菌体内,在L-阿拉伯糖的诱导下辅助质粒表达归巢内切酶和Red重组酶,打靶片段与染色体上同源区域重组,基因剔除。一步无痕敲除了大肠杆菌DH5α、JM109、HB101、Bl21（DE3）的ptsG基因和DH5α的ptsHIcrr操纵子;在含1%葡萄糖的LB培养基中,DH5α△ptsG、JM109△ptsG、HB101△ptsG、Bl21（DE3）△ptsG最高菌体密度依次是亲本的2.99、3.49、1.58、1.70倍;DH5α△ptsHIcrr最高菌密度是亲本的1.51倍;E.coli K12菌株DH5α△ptsG、JM109△ptsG产乙酸能力下降,基因芯片结果揭示ptsG敲除菌对敲除菌新陈代谢有广泛影响,尤其是糖酵解循环减弱,而三羧酸循环加强,使得两循环之间趋于平衡。在LB培养基中,DH5α△ptsHIcrr的生长行为与DH5α和DH5α△ptsG明显不同,其最高菌密度是DH5α和DH5α△ptsG的近2倍。而DH5α△ptsG生长行为与DH5α无明显差异。但在含1%葡萄糖的LB中,DH5α△ptsHIcrr和DH5α△ptsG均表现出生长优势,最高菌密度依次是DH5α的2.8倍、2倍;培养液中最终乙酸含量分别是DH5α的12.2%、47%。在M9修饰培养基中,DH5α△ptsHIcrr比生长速率(h-1)和比葡萄糖消耗速率(g·g-1·h-1)明显低于DH5α,并略低于DH5α△ptsG。结果说明,ptsHIcrr操纵子敲除菌改变了葡萄糖的代谢速率,并呈现与ptsG基因敲除菌不同的代谢特点。ptsG缺陷株有望用于高密度发酵;此外,DH5α△ptsHIcrr比葡萄糖消耗速率为后续进一步构建生产莽草酸及其他芳香族氨基酸工程菌株打下基础。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-10
缩略表  10-11
第一章 文献综述  11-30
  前言  11-12
  1 PTS 系统概述  12-15
    1.1 功能型PTS 介导的葡萄糖转运  13-14
    1.2 GalP 和Glk 介导葡萄糖转运途径  14-15
  2 PTS 系统分子改造进展  15-20
    2.1 ptsG 缺陷株及应用  15-18
    2.2 ptsHIcrr 缺陷株及GalP 表达可控化  18-20
  3 基因修饰研究进展  20-24
    3.1 两步Red 重组技术  20-21
    3.2 Cre/loxP 切除系统  21-22
    3.3 RecA 重组、Red 和I-SceⅠ基因修饰技术机制  22-23
    3.4 Red 同源重组系统的优化  23
    3.5 Red 同源重组应用  23-24
  4 本实验研究意义  24
  参考文献  24-30
第二章 大肠杆菌ptsG 基因的快速敲除及敲除菌性能测定  30-57
  1 材料与方法  30-41
    1.1 材料  30-33
    1.2 方法  33-41
  2 结果与分析  41-54
    2.1 打靶质粒pG 构建  41-42
    2.2 ptsG 阳性敲除菌落PCR 鉴定  42
    2.3 ptsG 阳性敲除菌的传代及分离  42-43
    2.4 ptsG 敲除菌生长性能  43-54
  3 讨论  54-55
  参考文献  55-57
第三章 E.coli ptsHIcrr 操纵子快速敲除及敲除菌性能测定  57-73
  1 材料与方法  57-65
    1.1 材料  57-59
    1.2 方法  59-65
  2 结果和分析  65-70
    2.1 打靶质粒构建及ptsHIcrr 敲除菌  65-66
    2.2 DH5α△ptsHIcrr、DH5α△ptsG 及DH5α生长代谢特征比较  66-68
    2.3 EGFP 蛋白表达及分析  68-70
  3. 讨论  70-71
  参考文献  71-73
结论  73-74
致谢  74-75
硕士研究生期间论文发表  75

相似论文

  1. 大肠杆菌和沙门氏菌定量检测方法的建立和试剂盒的研制,S154.3
  2. 军曹鱼生长激素基因（GH）的克隆和表达,Q786
  3. 鸡源禽致病性大肠杆菌分离鉴定及其毒力相关基因分布特征分析,S852.61
  4. 腐生葡萄球菌M36耐有机溶剂脂肪酶基因的克隆与表达,Q78
  5. 灵芝异戊二烯焦磷酸异构酶基因的克隆及其表达特性的研究,S567.31
  6. 基于恒压式超高压技术的黄瓜汁杀菌与保鲜研究,TS255.5
  7. 银翘散及金银花提取物对大肠杆菌的体外抑制作用研究,S853.7
  8. 四种氧化物纳米材料在自然沉降过程中对大肠杆菌毒性研究,R318.08
  9. 重庆市猪源大肠杆菌对β-内酰胺类药物耐药性的研究,S852.61
  10. 产琥珀酸重组大肠杆菌的构建和发酵性能研究,TQ921.7
  11. 聚羟基丁酸酯颗粒在重组人组织纤溶酶原激活剂（rPA）表达中的应用,Q78
  12. 猪水肿病大肠杆菌毒力基因突变菌株对猪的免疫效果研究,S858.28
  13. 致鹅卵黄性腹膜炎大肠杆菌cya、crp双基因缺失突变株的构建及其相关功能性分析,S852.61
  14. 饲用抗生素对大肠杆菌耐药性累计和代谢活动以及对仔猪生产性能的影响,S816.73
  15. 大肠杆菌O157的检测及生物学特性研究,S852.61
  16. 小牛凝乳酶基因在大肠杆菌中可溶性表达研究,Q78
  17. 抗黄曲霉毒素B1单链抗体基因的改造、表达纯化和性质研究,Q78
  18. 免疫磁球的制备及其在大肠杆菌检测中的应用,R446.6
  19. 利用重组工程技术构建多价DNA疫苗载体及大肠杆菌活菌疫苗载体的分析比较,R392
  20. 大肠杆菌释磷聚磷特性研究,X703

中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
© 2012 www.xueweilunwen.com