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小麦叶绿体表达载体构建和遗传转化

作　者: 任科云
导　师: 何光源；刘勇
学　校: 华中科技大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 小麦叶绿体基因组表达载体同源重组基因克隆外源基因遗传转化
分类号: S512.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 62次
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内容摘要

1962年,Ris和Plaut首次证明了叶绿体中存在DNA以来,烟草、水稻、玉米、菠菜、苜蓿、衣藻等多种高等植物和藻类的叶绿体基因组的测序工作已经完成。多年以来进行的核基因工程,因花粉漂移现象造成对生物的安全问题而引起争议。而叶绿体具有母性遗传、定点整合、高效表达、安全性和稳定性好等优点,受到更多研究者的关注。目前,叶绿体的遗传转化体系已经在烟草、马铃薯、番茄、油菜、水稻等几种植物中获得成功。而在主要的粮食作物小麦中,此方面的研究还比较少。本课题参考其他作物的转化体系的方法来建立小麦叶绿体转化体系,此体系对小麦的分子育种有着重大的影响。得到如下结果:1)从Genbank数据库中查到小麦叶绿体基因组基因rbc L和trn M、trn V基因,设计2对特异引物,从小麦叶绿体基因组中克隆到2个片段,作为小麦叶绿体遗传转化的2个同源重组片段。2)在上述得到2个同源重组片段的基础上,首先利用生物信息学的手段预测小麦叶绿体基因16 S rRNA特异启动子区域,然后通过PCR方法从小麦叶绿体基因组中分离到16 S rRNA的启动子。3)用分离到的启动子序列分别连接筛选基因npt II和报告基因gfp,并与烟草的PsbA 3’终止子组成表达框,构建小麦叶绿体基因组定点整合表达载体pRNGY。我们期望通过基因枪方法轰击小麦幼胚,经卡拉霉素筛选获得分化愈伤组织和抗性植株。我们成功的构建了小麦叶绿体表达载体,但是在进行遗传转化时我们没有取得成功。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
1 绪论  9-23
  1.1 课题背景  9
  1.2 叶绿体  9-10
  1.3 叶绿体基因组  10-12
  1.4 叶绿体转化  12-19
  1.5 启动子的克隆与分离  19-21
  1.6 本课题研究的目的和意义  21
  1.7 本课题实验技术方案  21-23
2 材料与方法  23-42
  2.1 实验材料  23-27
  2.2 实验方法  27-42
3 结果与分析  42-59
  3.1 叶绿体基因组DNA 提取质量及注意事项  42
  3.2 引物设计  42-46
  3.3 PCR 扩增  46-48
  3.4 DNA 片段产物回收  48-49
  3.5 菌落PCR  49-51
  3.6 质粒的提取  51-52
  3.7 双酶切  52-54
  3.8 测序结果分析  54-57
  3.9 基因枪转化  57-59
4 讨论  59-61
  4.1 同源片段的选择与扩增  59
  4.2 启动子的预测和扩增  59
  4.3 目的片段的酶切  59-60
  4.4 基因枪转化的植株  60-61
5 总结与展望  61-63
  5.1 主要研究成果  61
  5.2 有待继续开展工作  61-63
致谢  63-64
参考文献  64-68
附录 1 质粒和载体图  68-71
附录 2 测序结果  71-74

小麦叶绿体表达载体构建和遗传转化

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