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血管瘤型J亚群禽白血病病毒全基因组核酸序列分析及gp85基因的原核表达

作　者: 石敏
导　师: 黄勇
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 血管瘤型J亚群禽白血病 祖代种鸡分离株 全基因组序列 gp85蛋白 原核表达
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


J亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus Subgroup J, ALV-J)属于反转录病毒,能够诱发本地鸡和野生禽类产生肿瘤、生长迟缓、免疫抑制等,给养禽业带来了巨大的经济损失和严重威胁。J亚群禽白血病病毒自1989年由英国学者分离鉴定出以来,主要引起肉鸡的骨髓瘤白血病,但近年来,以往曾研究证实不易发生肿瘤的中国商品代蛋鸡和地方种鸡受到ALV-J感染后也能诱导产生较高的肿瘤发生率。此外,以往少见的由ALV-J引发的血管瘤病例近几年逐渐增多。这足以表现出不同地域ALV-J感染的特殊性和复杂性。本研究通过接种鸡胚成纤维细胞(CEF)RT-PCR及PCR检测技术,首次从四川某祖代种鸡场患病鸡中分离鉴定出一株血管瘤型J亚群禽白血病病毒,命名为SCDY1.以分离株SCDY1感染的CEF基因组DNA作为扩增其前病毒基因组模板,根据已公布的原型毒株HPRS-103序列设计合成9对引物,经PCR扩增出9段连续的、部分相互重叠的DNA片段,然后分别连入pMD19-T载体进行克隆并测序。经软件分析,ALV-J分离株SCDY1的前病毒全基因组核苷酸序列最终完成。禽白血病病毒的亚型主要是由病毒膜表面糖蛋白gp85决定的,根据SCDY1病毒株全基因组测序中gp85基因的测序结果,利用Primer permier 5.0设计一对表达引物,用于扩增gp85基因并构建原核表达载体PET-32a(+)/gp85,在大肠杆菌Rosetta中进行表达。结果表明,SCDYl;株cDNA基因组全长7489 bp。将该序列与GeneBank公布的其它ALV-J毒株全基因组序列进行同源比较,SCDY1株基因组的gag和pol基因相对保守,env基因变异性相对较大。在核苷酸水平上,gag、pol和env基因的同源性分别为94.3-96.5%,96.6-97.6%,90.3-94.2%；在氨基酸水平上,gag、pol和env的同源性分别为96.2-98.4%,97.4-98.7%,85.1-90.7%。SCDYl株E元件和non-functional TM序列几乎完全缺失,在3’UTR的U3区也出现了11个连续核苷酸序列的缺失。U3区转录调控元件分析表明,SCDYl:株U3区11 bp的缺失序列位于调控元件CArGbox的上游,类似于人类基因Apo-AI的转录因子ABI REP1,它可以为HNF-4提供结合位点,与之相结合,而HNF-4又可以作为一种阻遏子,在真核基因调控中起重要作用。此外,构建的原核表达系统成功获得了血管瘤型ALV-J病毒株的gp85蛋白,该蛋白的分子量约为57KD,与预计相符。表达的目的蛋白以包涵体的形式存在于菌体蛋白中。经Western-blot分析表明,该表达产物具有良好的反应原性。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-8
英文缩略表  8-10
目录  10-12
第一部分 前言  12-22
  1 病原学  13-17
    1.1 生物学分类地位  13
    1.2 病毒粒子结构  13
    1.3 基因组结构  13-15
    1.4 病毒稳定性  15
    1.5 病毒的培养特性  15
    1.6 病毒的致病性  15-16
    1.7 病毒致肿瘤机制  16-17
  2 ALV-J流行病学  17-18
  3 ALV-J临床症状  18
  4 ALV-J的鉴别和诊断  18-20
    4.1 ALV-J的分离与鉴定  18-19
    4.2 ALV-J单克隆抗体的应用  19
    4.3 ALV-J的PCR检测  19-20
  5 ALV-J的防治  20-21
  6 研究的目的和意义  21-22
第二部分 试验研究  22-56
  第一章 血管瘤型J亚群禽白血病病毒四川株SCDY1全基因组核酸序列分析  22-43
    1 材料  22-25
      1.1 病料与细胞  22
      1.2 菌株与载体  22-23
      1.3 试验试剂  23-24
        1.3.1 主要试剂  23
        1.3.2 常用试剂的配制  23-24
      1.4 主要试验仪器  24-25
      1.5 引物的设计  25
    2 试验方法  25-31
      2.1 病毒的分离与鉴定  25-27
        2.1.1 病毒的分离  25-26
        2.1.2 病毒的鉴定  26-27
      2.2 SCDY1全基因组核酸序列的测定  27-30
        2.2.1 SCDY1全基因组核酸序列的PCR扩增  27
        2.2.2 SCDY1 cDNA末端序列的扩增  27-28
        2.2.3 胶回收  28
        2.2.4 各段基因的TA克隆  28
        2.2.5 重组质粒的转化  28-29
        2.2.6 重组质粒的筛选和鉴定  29-30
      2.3 SCDY1分离株全基因组的遗传变异分析  30-31
    3 试验结果  31-40
      3.1 病毒分离与鉴定  31-32
        3.1.1 PCR扩增结果  31
        3.1.2 RT-PCR扩增结果  31-32
      3.2 SCDY1全基因纰核酸序列测定结果  32-36
        3.2.1 全基因PCR扩增结果  32-33
        3.2.2 全基因各段基因双酶切鉴定结果  33-34
        3.2.3 SCDY1毒株全基因组核苷酸序列的建立  34-36
      3.3 SCDY1前病毒cDNA全基因组序列与已知ALV-J毒株相应序列的同源性比较  36-40
        3.3.1 结构基因gag、pol和env的比较  36
        3.3.2 LTR区段的比较  36-37
        3.3.3 3’UTR分析  37-38
        3.3.4 U3区潜在转录因子结合位点分析  38-39
        3.3.5 前病毒cDNA全序列遗传进化分析  39-40
    4 讨论  40-42
    5 小结  42-43
  第二章 血管瘤型J亚群禽白血病病毒SCDY1株gp85基因的原核表达  43-56
    1 材料  43-45
      1.1 毒株、菌株及载体  43
      1.2 主要试剂  43-44
      1.3 试验仪器  44
      1.4 试剂配制  44-45
        1.4.1 基因表达相关试剂  44-45
        1.4.2 蛋白纯化及鉴定相关试剂  45
    2 方法  45-49
      2.1 gp85基因的生物信息学分析  45
      2.2 引物的设计  45-46
      2.3 原核表达载体的构建  46
        2.3.1 重组质粒的抽提与Rosetta(DE3)感受态细胞的制备  46
        2.3.2 带粘性末端的gp85基因与pET-32a(+)载体的酶切  46
        2.3.3 连接、转化及鉴定  46
      2.4 pET-32-gp85的表达  46-48
        2.4.1 重组质粒pET-32-gp85的表达  46-47
        2.4.2 SDS-PAGE鉴定  47
        2.4.3 表达条件的筛选优化  47-48
        2.4.4 表达产物的初步纯化  48
      2.5 Western-blot分析  48-49
    3 结果  49-53
      3.1 gp85基因的生物信息学分析  49-50
      3.2 gp85蛋白表达载体的构建  50-51
      3.3 pET-32-gp85的表达  51-52
        3.3.1 表达条件的优化  51-52
        3.3.2 重组表达蛋白初步纯化结果  52
      3.4 表达蛋白Westem-blot分析  52-53
    4 讨论  53-54
    5 小结  54
    6 结论  54-56
参考文献  56-61
致谢  61-62
攻读学位期间发表的学术论文  62

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