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家蚕PMP22基因的表达研究

作　者: 吕玮
导　师: 张耀洲
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 家蚕PMP22基因膜蛋白原核表达 Bac-to-Bac表达系统 Western blot
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

膜蛋白在细胞活动中占有非常重要的地位,但膜蛋白的表达和制备却相当困难。我们将多角体蛋白与膜蛋白PMP22融合,以探索该膜蛋白基因的高效表达方法。我们从本实验室所构建的家蚕cDNA文库中筛选到一条阅读框为561 bp,编码186个氨基酸残基的序列,生物信息学分析发现其编码的蛋白质预测分子量为22 kD,等电点为10.41,为家蚕过氧化物酶体膜蛋白。该蛋白含有一个属于Mpv17_PMP22超家族的保守结构域,并具有4个强疏水性的跨膜区,为整合膜蛋白,将其命名为家蚕PMP22(Peroxisomal membrane protein 22),GenBank登录号为:LOC733112。我们将PMP22基因的ORF插入质粒pBacPAK8-Ph的多克隆位点,获得含融合基因Ph-PMP22的重组质粒。大量扩增该重组质粒后,双酶切获得Ph-PMP22,再将其克隆到原核表达载体pET-28a上,成功构建了重组表达质粒pET-28a-Ph-PMP22,经PCR、酶切及测序鉴定后,获得正确的重组质粒。将该重组质粒分别转化大肠杆菌BL21 star(DE3)、BL21(DE3)及Rosetta(DE3),筛选得到三种工程菌,再分别接种培养,以终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导后加热裂解菌体进行SDS-PAGE电泳分析,结果表明没有明显的特异性表达条带,加大诱导时间后也没有明显改变;Western blot检测发现融合蛋白在Rosetta菌中有一定表达,经SDS-PAGE凝胶扫描分析,目的蛋白含量有少量表达。利用Bac-to-Bac系统,我们将原核表达中获得的Ph-PMP22融合基因与质粒pFastBac重组,经PCR、酶切及测序鉴定筛选重组子pFastBac-Ph-PMP22,提取该重组子转化含有穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac,Bacmid与pFastBac-Ph-PMP22发生转座,获得含融合基因Ph-PMP22的重组Bacmid。以pUC/M13扩增引物进行PCR鉴定,结果表明重组成功。以重组的Bacmid转染家蚕BmN细胞,待发病后收集细胞,裂解细胞进行SDS-PAGE电泳分析,没有发现明显的特异性表达。而Western blot检测表明细胞破碎后的上清中不存在目的融合蛋白,沉淀中则存在少量目的融合蛋白,且表达量低于上述原核系统中的结果。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-10
缩略语  10-11
第一章过氧化物酶体及其膜蛋白的研究进展  11-25
  1 前言  11-12
  2 过氧化物酶体的功能  12-16
    2.1 脂肪酸的β氧化  12-13
    2.2 调节细胞中的氧浓度  13-14
    2.3 磷脂酸的合成  14
    2.4 抗病毒作用  14-15
    2.5 过氧化物酶体与相关疾病  15-16
  3 过氧化物酶体膜蛋白  16-19
    3.1 过氧化物酶体膜蛋白的结构和功能  16-17
    3.2 22kD 的过氧化物酶体膜蛋白（PMP22）  17-19
  4 过氧化物酶体蛋白的识别与装配  19-22
    4.1 过氧化物酶体基质蛋白的输入  19-21
    4.2 过氧化物酶体膜蛋白的输入  21-22
  5 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统  22-24
  6 研究展望  24-25
第二章实验设计方案  25-28
  1 实验目的和意义  25
  2 研究内容  25-27
  3 实验流程图  27-28
第三章生物信息学分析  28-35
  1 生物信息学分析工具  28
  2 分析结果及流程  28-33
    2.1 家蚕PMP22 基因的序列分析  28-29
    2.2 家蚕PMP22 蛋白的跨膜区分析  29-30
    2.3 家蚕PMP22 蛋白的疏水性分析  30-31
    2.4 家蚕PMP22 蛋白的信号肽分析  31
    2.5 家蚕PMP22 蛋白的功能位点分析  31
    2.6 家蚕PMP22 蛋白与相关蛋白的同源性分析  31-33
  3 讨论  33-35
第四章Ph-PMP22 融合基因的原核表达  35-55
  1 材料与试剂  35-39
    1.1 材料  35
    1.2 试剂  35
    1.3 试剂的配制  35-39
  2 方法  39-48
    2.1 PMP22 基因的获取  39-41
    2.2 获取重组基因Ph- PMP22  41-44
    2.3 重组质粒pET-28a-Ph-PMP22 的构建  44-45
    2.4 重组质粒pET-28a-Ph-PMP22 的测序鉴定  45
    2.5 重组质粒pET-28a-Ph-PMP22 的原核表达  45-46
    2.6 融合蛋白的SDS-PAGE 电泳检测  46-47
    2.7 Western blot 鉴定  47-48
    2.8 Ph-PMP22 蛋白在E.coli BL21、E.coli Rosetta 中的表达  48
  3 结果  48-53
    3.1 扩增目的基因PMP22  48-49
    3.2 重组质粒的鉴定  49-51
    3.3 重组质粒的测序  51
    3.4 融合蛋白的诱导表达  51-52
    3.5 融合蛋白的Western blot 鉴定  52-53
  4 讨论  53-55
第五章 Ph-PMP22 重组基因的真核表达  55-67
  1 材料与试剂  55-56
    1.1 材料  55
    1.2 试剂  55
    1.3 试剂的配制  55-56
  2 方法  56-61
    2.2 重组质粒pFastBacTMHTB-Ph-PMP22 的构建  56-57
    2.3 重组质粒Bacmid-Ph-PMP22 的构建  57-59
    2.4 BmN 细胞的复苏与冻存  59-60
    2.5 重组Bacmid 的脂质体介导法转染家蚕BmN 细胞  60
    2.6 细胞中Bacmid 的PCR 鉴定  60
    2.7 Western blot 鉴定  60-61
  3 结果  61-65
    3.1 重组质粒pFastBacTMHTB-Ph-PMP22 的鉴定  61-62
    3.2 重组Bacmid 的PCR 鉴定  62-63
    3.3 细胞发病状态  63-64
    3.4 融合蛋白的Western blot 鉴定  64-65
  4 讨论  65-67
结论  67-68
参考文献  68-73
致谢  73

家蚕PMP22基因的表达研究

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