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犬小孢子菌膜蛋白PQ-LRP基因全长cDNA的克隆

作　者: 庞娟
导　师: 杨国玲
学　校: 大连医科大学
专　业: 皮肤病与性病学
关键词: 犬小孢子菌膜蛋白 PQ-LRP cDNA快速末端扩增法
分类号: R758.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 6次
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内容摘要

目的:犬小孢子菌病是由亲动物性真菌犬小孢子菌感染人类头皮、头发、平滑皮肤的传染性皮肤病。近年随着宠物饲养的增加,其发病率呈上升趋势。本课题组前期通过抑制消减杂交技术(SSH)成功构建了犬小孢子菌差异基因文库,通过比较儿童头皮诱导培养和儿童光滑皮肤生长状态下的犬小孢子菌基因表达的差异性,从中筛选出与头皮诱导培养相关的4条差异表达基因,并对获得的目标基因进行测序及实时荧光PCR进行定量,其中膜蛋白PQ-LRP(PQ loop repeat protein)基因在头皮组织诱导培养下较光滑皮肤具有高表达,这是否与犬小孢子菌易于侵犯儿童头皮组织有关引起我们的关注。目前国内外学者热衷于对犬小孢子菌的蛋白酶的研究,对膜蛋白的研究较少。故本课题组拟依据差异显示得到的PQ-LRP基因片段采用cDNA快速末端扩增法(RACE)得到膜蛋白PQ-LRP基因全长cDNA序列,并初步分析其结构与功能,为后期探讨此基因在头癣发病机制中的作用提供理论基础及新型药物的开发提供设计靶位。方法:采用经形态学鉴定及对其核糖体保守区基因序列测序鉴定的犬小孢子菌菌株为实验株,提取总RNA,按照SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit说明书(Clontech,美国),首先合成第一链cDNA,利用已知PQ-LRP基因片段,用PRIMER5.0软件设计3’/5’端基因特异性引物(gene specific primer, GSP1)和GSP2;巢式PCR引物(nested gene specific primer, NGSP1)及NGSP2。GSP1和GSP2分别与RACE通用引物UMP(长片段和短片段的混合物)进行第一轮PCR反应,以第一轮PCR产物为模板,分别利用NGSP1,NGSP2与巢式通用引物NUP进行第二轮PCR反应。对第二轮扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并进行切胶回收,纯化,克隆到pMD18-T载体,经双酶切鉴定为阳性克隆者,进行测序(北京华大基因),对测序结果使用DNAStar软件进行序列拼接,得到膜蛋白PQ-LRP基因全长cDNA序列。结果:1.犬小孢子菌头癣株A518,在沙堡固体及液体培养基中均生长良好,形成菌丝团块。2.根据犬小孢子菌PQ-LRP基因片段设计3’-RACE基因特异性引物及巢式PCR引物,从3’端扩增出一条长度为789bp的序列。3.根据犬小孢子菌PQ-LRP基因片段设计5’-RACE基因特异性引物及巢式PCR引物,从5’端扩增出一条长度为181bp的序列。4.将获得的3’末端与5’末端序列与已知序列拼接后得到1522bp的cDNA序列,其含有一个1080bp的开放阅读框(ORF),翻译359aa,5’端非编码区49bp,3’端非编码区393bp。此序列已成功提交至GenBank(GenBank登录号JF767222)。结论:1.所获得序列是一个全长的基因序列,具有完整的开放阅读框架;2.相似性对比:该序列与马发癣菌7次跨膜蛋白1及断发毛癣菌PQ-LRP同源性均达到81%,与红色毛癣菌PQ-LRP同源性为79%。

全文目录

中文摘要  6-8
英文摘要  8-10
前言  10-11
材料和方法  11-24
结果  24-27
讨论  27-31
结论  31-32
参考文献  32-35
综述  35-43
  参考文献  41-43
附录  43-44
致谢  44

犬小孢子菌膜蛋白PQ-LRP基因全长cDNA的克隆

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