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新型诱导剂钙离子载体联合GM-CSF体外诱导人外周血单核细胞生成树突状细胞的研究

作　者: 彭卫斌
导　师: 沙卫红；聂玉强
学　校: 广州医学院
专　业: 消化内科学
关键词: 树突状细胞 钙离子载体 细胞因子 细胞毒性T淋巴细胞 K562细胞
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


目的:1.用组合细胞因子诱导人外周血单核细胞(human peripheral blood mononuclear cell,PBMC)生成树突状细胞(Dendritic cell,DC)。2.用新型诱导剂钙离子载体(Calcium Ionophore,CI)A23187联合重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)体外诱导人外周血单核细胞生成DC。3.观察DC刺激细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对K562细胞(慢性髓性白血病细胞)产生的特异性杀伤作用。方法:试验一:1.采用密度梯度离心法及黏附法分离出PBMC,加入rhGM-CSF+重组人白介素- 4(rhIL-4)诱导,第5天加入重组人肿瘤坏死因子-α(rhTNF-α),继续培养2天,刺激DC成熟。2.倒置显微镜观察细胞形态、数量的变化。3.流式细胞仪检测DC的表面标志。4.通过四甲基偶氮唑盐比色法(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)检测DC刺激同种异体外周血T淋巴细胞增殖的能力。试验二:1.采用密度梯度离心法及黏附法分离出PBMC,分组培养: A:传统方法组,rhGM- CSF+ rhIL- 4,诱导72h后,加入rhTNF-α,继续培养24h; B:新型诱导剂组,加入rhGM- CSF+A23187,诱导96h。2. K562细胞抗原的制备:收集对数生长期K562细胞,反复冻融(-80℃/37℃),低温离心,取上清用微孔滤膜过滤,-20℃保存备用。3.培养开始时分别予K562细胞冻融抗原致敏,培养96小时后分别收集负载抗原的DC。4.倒置显微镜观察细胞形态、数量的变化。5.流式细胞仪检测DC的表面标志。6.将负载K562细胞抗原的DC刺激T淋巴细胞,通过MTT比色法检测各组DC刺激同种异体外周血T淋巴细胞增殖的能力。7.通过MTT比色法检测各组DC对K562细胞的抑制作用。8.通过MTT比色法检测各组DC激活的CTL对K562细胞的杀伤作用。结果:试验一:1. PBMC经rhGM-CSF及rhIL-4诱导培养5天后,多数细胞呈集落生长,加入rhTNF-α继续培养2天后,可见细胞有典型的树枝状突起并呈散在分布。2.培养第5天时,DC细胞表型CD83、CD1a、CD86、CD40及CD14分别是(14.3±2.2)%,(12.8±2.1)%,(20.1±1.8)%,(19.9±3.8)%及(16.2±3.3)%。加入TNF-α诱导后,即培养第7天,细胞表型CD83、CD1a、CD86、CD40及CD14分别是(29.8±4.4)%,(18.2±4.5)%,(33.6±4.2)%,(28.1±4.3)%及(8.0±2.8)%(与第5天比较,P值均<0.05)。3.成熟后的DC具备较强刺激T淋巴细胞增殖的能力,且增殖效应随效靶比的增加而增强。试验二:1. A23187联合rhGM- CSF诱导培养的DC具有典型的树突形态。2.与传统组比较,新型诱导剂组诱导的DC表面分子表达水平明显升高,分别为CD83(45.2±1.8)%vs(16.9±1.3)%;CD1a(31.5±3.9)% vs(20.4±3.4)%;CD86(40.1±7.8)% vs(26.5±2.2)%;CD40(36.4±6.3)% vs(22.3±3.0)%,P值均<0.05;而CD14表达明显下降,分别为(5.7±0.8)% vs(19.0±1.6)%,P<0.05。3.采用MTT比色法检测各组方法培养的细胞对同种异体T淋巴细胞的刺激作用,发现两组DC在体外均能有效地激发同种异体外周血T淋巴细胞的增殖,与传统方法相比,新型诱导剂组除效靶比为1:40的增值效应与前者相似,P>0.05,其它效靶比均明显强,P<0.05,且增殖效应随效靶比的增加而增强。4.与传统组比较,新型诱导剂组负载K562冻融抗原后的DC对K562细胞抑制作用更明显,效靶比为1:1及10:1时,抑瘤率分别为(25.33±3.76)% vs(15.55±2.39)%、(35.57±5.23)% vs(22.91±3.21)%,P值均<0.05。5.与传统组比较,新型诱导剂组负载K562冻融抗原后的DC激活的CTL对K562细胞有明显的杀伤作用,效靶比为10:1及40:1时,杀瘤率分别为(43.33±6.20)% vs(29.93±2.75)%、(60.97±5.18)% vs(43.14±4.75)%,P值均<0.05。结论:1.组合细胞因子rhGM-CSF+rhIL-4+rhTNF-α能诱导出成熟的DC,但培养时间长、容易污染及费用昂贵。2.新型诱导剂CI A23187联合rhGM-CSF能更有效地诱导PBMC生成成熟DC,培养时间短且费用低廉。3. K562冻融抗原冲击DC激活的CTL能够获得较强的杀伤K562细胞的能力。

全文目录


中英文对照缩略词表  3-4
中文摘要  4-7
英文摘要  7-10
前言  10-11
试验一 组合细胞因子体外诱导人外周血单核细胞分化为树突状细胞  11-17
  1. 材料与方法  11-14
  2. 结果  14
  3. 讨论  14-17
试验二 钙离子载体联合GM-CSF 体外诱导人外周血单核细胞生成树突状细胞及其激活细胞毒性T 淋巴细胞的抗肿瘤作用  17-26
  1. 材料  17-18
  2. 方法  18-21
  3. 结果  21-22
  4. 讨论  22-26
结论  26-27
图表  27-34
参考文献  34-38
综述  38-46
  参考文献  43-46
攻读硕士学位期间发表的学术论文  46-47
致谢  47-48

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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