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猪肌肉组织骨骼肌特异性基因α-actin启动子的克隆及功能验证

作　者: 刘京鸽
导　师: 蒋思文
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 猪组织特异性启动子 a-actin 双启动子组织特异性分析慢病毒基因转染细胞培养
分类号: S828
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

外源基因如何高效的在受体组织中表达是基因工程研究的关键。而外源基因的表达首先取决于其转录的启动。高等动物基因的表达具有时间和空间性。组织特异性启动子又称为器官特异性启动子。在这类启动子的作用下,基因的表达往往只限于某些特定的组织或器官,同时表现出发育调节等特性。但是到目前为止,分离和获得利用的组织特异性启动子少之又少,并且伴随着活性低组织特异性并不是很高的缺点。国外已分离利用的组织特异性启动子都有专利保护,这极大了限制了我国在转基因动物制药、畜禽的品种改良及各种疾病的靶向基因治疗等方面的应用。本论文选择了猪的骨骼肌特异性表达基因α-actin的启动子作为研究的对象,通过对其克隆、分离及功能验证获得调控能力相对较强的同时又保持肌肉组织特异性的启动子区域,并通过构建双启动子的策略力图改善启动子的活性并保证其组织特异性。为未来筛选可以高效利用的启动子打下基础。主要研究结果如下：1.利用比较基因组学的方法,将猪的骨骼肌特异性表达基因α-actin的DNA序列输入NCBI的BLASTn数据库,搜索获得此基因的上游调控序列。2.选择猪的α-actin基因包含部分第一内含子的上游调控序列2006bp,提交TESS、TFSEARCH及MethPrimer等生物信息学软件对其核心启动子区域、转录因子结合位点、不同转录元件及CpG岛分布情况进行预测预测和分析。发现此段序列存在启动子区的典型特征结构TATA box,含有肌肉组织特异性的诸多转录因子的结合元件,如MyoD、MEF2及MyoG等。3.根据生物信息学软件在线预测的结果,设计缺失引物,以已经扩增获得的2006bp的pMD18-T重组载体为模板,PCR扩增获得6个5’侧翼缺失片段和2个3’侧翼缺失片段。首先将这些片段插入到pMD18-T载体中,抽提质粒,酶切回收目的片段,再将这些片段插入到pGL3-basic载体中的报告基因萤火虫荧光素酶的上游多克隆位点处,构建相应的报告基因表达载体。将这些载体分别转染C2C12、PK及分化的C2C12细胞,通过双荧光素酶报告系统分析报告基因萤火虫荧光素酶的相对活性,从而获得不同的缺失片段在相同的细胞中及相同的缺失片段在不同的细胞中启动活性的强弱。结果表明这几个缺失片段在分化的C2C12中表达活性最高,其次是C2C12细胞,表达活性最低的是PK细胞。最终获得了相对表达活性最高并同时保持肌肉组织特异性的268bp的核心区段。4.分别设计引物,以pIRES2-AcGFP1为模板,PCR扩增获得启动子CMV560bp、SV40 231bp的核心区段。5.通过添加酶切位点的方式,分别将启动子CMV、SV40及初步筛选到的猪的骨骼肌特异性表达基因a-actin启动子区的具备肌肉组织特异性且表达活性相对较高的区段插入到pGL3-basic载体中的报告基因萤火虫荧光素酶的上游多克隆位点处,构建四种分别包含组成型启动子CMV或者是SV40及猪的骨骼肌特异性表达基因α-actin启动子的双启动子的报告基因表达载体。分别将这四种不同的表达载体利用脂质体转染法瞬时转染C2C12、PK及分化的C2C12细胞。通过双荧光素酶报告系统检测荧光素酶的活性。结果发现：(1)CMV或者是SV40可显著改善猪的骨骼肌特异性表达基因α-actin启动子的活性,其中启动子CMV的效果尤其明显。(2)包含不同组合的双启动子的表达载体在分化的C2C12细胞中表达活性最高,依次为C2C12、PK。6.以质粒pDsRed-N1为模板,扩增获得携带酶切位点Bg/Ⅱ和HindⅢ的RFP片段,连至重组载体pGL3-basic-Q8的a-actin启动子Q8的下端,此重组载体命名为Q8-R。以此重组载体为模板扩增携带酶切位点ClaⅠ、EcoRⅠ的Q8-RFP片段,连入慢病毒载体pLenti7.3/V5-GW/lacZ中,获得重组载体LV-Q8-R.

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
第一章文献综述  12-19
  1 前言  12
  2 启动子的结构特点及分类  12-13
  3 组织特异性启动子在应用的过程中存在的问题及解决的方法  13-15
  4 启动子结构和功能的研究方法  15-16
    4.1 启动子结构的研究方法  15
    4.2 启动子功能的验证  15-16
  5 慢病毒载体在组织特异性启动子的活体验证中的应用  16-17
  6 骨骼肌特异性表达基因α-actin的研究进展  17-18
  7 研究的目的和意义  18-19
第二章材料和方法  19-41
  1 试验材料  19-24
    1.1 DNA样品  19
    1.2 所用试剂及药品  19-20
    1.3 所用载体和细胞  20-23
    1.4 常用试剂的配制  23-24
      1.4.1 细胞培养所用试剂的配制  23
      1.4.2 荧光素酶活性检测所需试剂的配制  23-24
    1.5 主要生物学软件  24
  2 试验方法  24-41
    2.1 猪α-actin基因启动子的分离及功能验证  24-34
      2.1.1 猪α-actin基因上游调控序列的获得  24
      2.1.2 缺失片段的引物设计  24-26
      2.1.3 PCR产物的检测、回收及纯化  26
        2.1.3.1 PCR产物的检测  26
        2.1.3.2 PCR产物的回收及纯化  26
      2.1.4 PCR产物的加尾及纯化  26-27
      2.1.5 PCR产物的克隆及测序  27-28
        2.1.5.1 载体连接  27
        2.1.5.2 连接产物的转化  27
        2.1.5.3 阳性克隆的筛选及测序  27-28
      2.1.6 T1-T8的小量提取及酶切回收  28-29
        2.1.6.1 T1-T8的小量提取  28-29
        2.1.6.2 T1-T8的双酶切及缺失片段的回收  29
      2.1.7 pGL3-basic-Q1-pGL3-basic-Q8的构建  29-31
        2.1.7.1 缺失片段同pGL3-basic载体的连接、重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定  29-30
        2.1.7.2 pGL3-basic-Q1-pGL3-basic-Q8可用于细胞转染的质粒的小量提取  30-31
        2.1.7.3 pGL3-basic-Q1-pGL3-basic-Q8的双酶切及测序鉴定  31
      2.1.8 C2C12细胞系及猪的PK细胞的培养  31-32
        2.1.8.1 冻存细胞的复苏  31
        2.1.8.2 细胞的培养和传代  31-32
        2.1.8.3 细胞的冻存  32
      2.1.9 C2C12细胞的诱导分化  32
      2.1.10 细胞的转染  32-33
      2.1.11 双荧光素酶活性的检测  33-34
        2.1.11.1 细胞的裂解  33-34
        2.1.11.2 双荧光素酶活性的检测  34
      2.1.12 数据的处理及分析  34
    2.2 双启动子的构建及表达活性、组织特异性的鉴定  34-38
      2.2.1 双启动子的构建  34-38
        2.2.1.1 CMV、SV40及α-actin核心启动子的扩增  34-35
        2.2.1.2 TA克隆重组质粒的小量提取及酶切回收  35-36
        2.2.1.3 CMV、SV40的pGL3-basic重组载体的小量提取及酶切鉴定  36
        2.2.1.4 双启动子的重组质粒pGL3-basic的小量提取及酶切鉴定  36-38
      2.2.2 双启动子驱动的荧光素酶活性及组织特异性的检测  38
    2.3 慢病毒重组载体pLenti7.3/V5-GW的构建  38-41
      2.3.1 RFP的重组载体pMD18-T的构建  38-39
      2.3.2 Q8同RFP的嵌合片段的获得  39
      2.3.3 重组载体pLenti7.3的构建  39-41
第三章结果与分析  41-62
  1 猪α-actin启动子的克隆及功能分析  41-50
    1.1 猪α-actin启动子的生物信息学分析  41-43
      1.1.1 猪α-actin启动子的获得  41
      1.1.2 猪α-actin启动子结构的生物信息学预测  41-43
    1.2 猪α-actin启动子的重组载体PGL3-basic的构建  43-47
      1.2.1 猪α-actin启动子缺失片段的获得  43-44
      1.2.2 T1-T8的构建及酶切回收  44-45
      1.2.3 pGL3-basic-Q1--pGL3-basic-Q8的构建及酶切鉴定  45-47
    1.3 C2C12的诱导分化  47
    1.4 Q1-Q8驱动的荧光素酶活性的检测  47-50
  2 双启动子的构建及其驱动下的LUC活性、组织特异性的检测  50-58
    2.1 CMV、SV40启动子的克隆  50-51
    2.2 双启动子的构建  51-54
    2.3 双启动子驱动下的LUC活性及组织特异性的检测  54-58
  3 慢病毒重组载体pLenti7.3的构建  58-62
    3.1 RFP的扩增及其重组载体TA-R的构建  58-59
    3.2 重组载体Q8-R的构建及酶切鉴定  59-60
    3.3 重组载体pLenti7.3的构建及酶切鉴定  60-62
第四章讨论  62-68
  1 启动子的获得及功能的细胞水平的验证  62
  2 双荧光素酶报告系统在启动子研究中的应用  62-63
  3 关于组织特异性调控元件筛选的策略  63-64
  4 关于改善启动子活性的研究策略  64-65
  5 猪α-actin启动子活性的分析  65-68
    5.1 猪α-actin启动子结构的生物信息学分析  65-66
    5.2 猪α-actin启动子在C2C12、PK及分化的C1C12细胞中的活性  66-67
    5.3 双启动子在PK及分化的C1C12细胞中的活性分析  67-68
第五章小结  68-70
  1 本研究获得的结果  68-69
  2 下一步的工作  69-70
参考文献  70-76
附录1: 2006bp的上游模板序列  76-77
附录2: pGL3.basic/Q1-Q8重组质粒序列  77-81
附录3: 四种双启动子重组质粒序列  81-83
致谢  83

猪肌肉组织骨骼肌特异性基因α-actin启动子的克隆及功能验证

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