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慢病毒介导HO-1基因转染对骨髓间充质干细胞体外缺血性损伤保护作用的实验研究

作　者: 孙海军
导　师: 钱永跃
学　校: 苏州大学
专　业: 胸心外科学
关键词: 慢病毒 HO-1 骨髓间充质干细胞 基因转染 缺血性损伤 保护作用
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的:通过慢病毒介导HO-1基因转染猪骨髓间充质干细胞(MSCs),并建立体外模拟缺血性损伤模型,探讨HO-1基因修饰对MSCs缺血性损伤的保护作用及其机制。从而为下一步HO-1基因修饰的MSCs移植治疗心肌缺血的研究提供实验依据。方法:采用密度梯度离心结合贴壁法分离、培养猪MSCs,并用免疫荧光法鉴定;用慢病毒包装系统介导的HO-1基因转染猪MSCs,通过荧光显微镜观察并绘制转染HO-1基因的MSCs(HO-1-MSCs组)、未转染HO-1基因的MSCs(MSCs组)生长曲线,观察慢病毒转染对MSCs增殖的影响。PCR检测HO-1-MSCs组、MSCs组的HO-1mRNA表达;采用血清剥夺和缺氧(SOD)处理建立MSCs体外模拟缺血性损伤模型,通过流式细胞术检测评价HO-1-MSCs组、MSCs组在SOD后3h、6h及9h时的凋亡、死亡情况,并通过RT-PCR、Western blot技术检测两组在SOD各个时间点的HO-1mRNA及HO-1蛋白的表达情况。结果:密度梯度离心结合贴壁法能有效分离、纯化猪MSCs,转染48小时后,可检测到强荧光出现,免疫荧光染色显示培养的细胞CD44、CD105表达阳性;细胞计数并绘制生长曲线结果显示,转基因的MSCs与未转基因的MSCs生长曲线没有显著差别,无统计学意义;HO-1-MSCs组较MSCs组在常氧培养条件下凋亡率(AR)(P>0.05)和死亡率(DR)没有显著差别(P>0.05),无统计学意义;两组MSCs在各SOD时间点的AR和DR较常氧培养条件下均显著性增高(P<0.01),有统计学意义。在同一SOD时间点,HO-1-MSCs组较MSCs组的AR显著性降低(P<0.01),有统计学意义。RT-PCR、Western blot结果显示:在常氧培养条件下,HO-1-MSCs组较MSCs组的HO-1mRNA和HO-1蛋白表达均显著增高(P<0.01),有统计学意义;在各SOD时间点,两组MSCs的HO-1mRNA和HO-1蛋白表达较常氧均显著性增高(P<0.01),有统计学意义;随着SOD时间延长,两组MSCs的HO-1mRNA和蛋白表达均逐步增强;在同一SOD时间点,HO-1-MSCs组较MSCs组的HO-1mRNA和HO-1蛋白表达均显著性增加(P<0.01),有统计学意义。结论:1.根据黏附特性可成功分离、培养获得猪骨髓MSCs。2.按MOI=20,慢病毒包装系统可成功将HO-1基因转染MSCs:效率肯定、相对安全,且对MSCs的增殖没有明显影响。3.本实验结果显示:HO-1基因转染及其蛋白的稳定表达可提高缺氧、缺血环境下MSCs的生存能力,对抗体外模拟缺血性损伤引起的细胞凋亡,从而具有保护性作用。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-9
前言  9-11
第一部分 猪骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、培养、表型鉴定  11-18
  材料和方法  11-13
  结果  13-16
  讨论  16-18
第二部分慢病毒系统介导的HO-1 基因转染骨髓干细胞及检测  18-28
  材料和方法  18-23
  结果  23-26
  结论  26-28
第三部分 HO-1 基因转染对骨髓间充质干细胞体外缺血缺氧环境下凋亡的影响  28-40
  材料和方法  28-33
  结果  33-37
  讨论  37-40
结论  40-41
参考文献  41-47
综述  47-60
  参考文献  55-60
中英文对照缩略词表  60-62
攻读学位期间本人撰写及公开发表论文  62-63
致谢  63-64

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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