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牙鲆HSP70与HSC70基因的克隆、表达及其SNPs与耐热性状的相关性分析

作　者: 刘旭东
导　师: 张全启
学　校: 中国海洋大学
专　业: 发育生物学
关键词: 牙鲆选择育种遗传力温度耐受性 Hsc70 Hsp70 基因克隆 Real-time PCR SNP
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

牙鲆(Paralichthys olivaceus)是重要的海水养殖鱼类,其肉质细嫩,味道鲜美,营养丰富,深受消费者喜爱。我国的牙鲆增产养殖业从20世纪80年代开始得到了迅猛发展。然而,牙鲆养殖业的发展也带来了诸多不容忽视的问题,随着工厂化养殖规模的扩大、养殖环境不断恶化、以及牙鲆的高繁殖能力使得国内大部分养殖基地亲本繁育群体过小和更换率过低,导致牙鲆养殖群体遗传多样性的降低,使得现在养殖的牙鲆出现疾病爆发频繁、死亡严重、养殖效益大幅下降的情况。因此急需培育生长速度快,抗病能力高、抗逆性强的牙鲆新品种来满足当前养殖业的迫切需要,为此我们做了以下工作:1.牙鲆的选育效果评估为了评估牙鲆(Paralichthys olivaceus)人工选育的育种效果,以2007年经过家系选育的具有优良生长性状的第一代个体为亲本,依据巢式交配设计,构建了第二代10个半同胞家系和20个全同胞家系。在养殖4个月后进行生长性状的测定,对比测试结果表明,经过选育的群体的平均体质量比未经选育的对照组提高了2.91克,遗传增益为11.25%,显著高于未经选育的群体(p<0.05);经过选育的群体全长极显著显著高于未经选育的群体(p<0.01),全长的遗传增益较未选育的群体提高了1.33厘米,遗传增益为10.36%。初步达到了改良生长性状的效果。体重、全长和体高的遗传力为分别为0.656~0.731,0.481~0.742,0.480~0.651,均属于高等遗传力,显示牙鲆选择育种仍旧可以取得较快的遗传进展,具有较大的选择潜力。2. Hsp70与Hsc70基因的克隆及表达分析Hsp70是热休克反应(heat shock reaction,HSR)中生成最为显著、最主要的一种应激蛋白。它能通过分子伴侣作用与蛋白分子结合,保护新合成蛋白分子的正确构型并参与蛋白分子在细胞内的转运和组装;当蛋白受损变性时,能促使其恢复,或加速其降解与清除;能重新激活某些酶,以维护细胞的功能和生存。研究表明,Hsc70属于结构型蛋白主要存在于正常细胞,而Hsp70仅出现在应激细胞,且在细胞受到应激时增加明显。本研究克隆获得了牙鲆热休克蛋白Hsp70及其同源蛋白Hsc70的基因cDNA和DNA全长,并对二者在热激条件下的表达情况进行了分析。Hsp70的cDNA总长为2006bp,包括5’UTR 109bp,3’UTR 160bp以及编码区1923bp,可编码640个氨基酸。DNA总长2646bp,其中编码区内无内含子,位于编码区5端外侧含有一个符合GT-AG规则的长454bp的内含子。Hsc70的cDNA总长为2068bp,包括5’UTR 60bp,3’UTR31bp以及编码区1953bp,其ORF编码650个氨基酸。Hsc70基因DNA全长3046bp,序列包括8个外显子,7个内含子。方差分析表明,在牙鲆的心肌细胞中,正常条件下(0h),Hsp70几乎不表达,当瞬时的热激处理后,hsp70开始大量表达,并随着热胁迫时间的增加表达量逐渐降低,到达8小时的时候几乎不表达。在未经热处理的对照组中(0h),Hsc70大量表达。在热休克开始之后,其表达很快受到抑制,表达量几乎为0,在此后的8个小时内几乎都没有表达的情况发生。同时发现2个具有耐热表现型差异的家系之间Hsp70的表达情况没有差异(p>0.05),Hsp70的表达情况与家系之间也没有交互作用发生(p>0.05)。3 .HSP70的SNP位点与牙鲆耐热性状的关联分析我们扩增并测序了60条筛选出来的具有耐热性状差异的牙鲆群体Hsp70基因(相对耐热与不耐热牙鲆各30尾),测序和筛查结果共发现了24个SNP位点,其中的12个位于非翻译区,12个位于翻译区。在这24个位点中,同义突变有23个,占总数的96%,而非同义突变只有1个,且为同类型氨基酸。经过检验分析,我们最终将ID为1、2、5、8、15号的SNP作为下一步验证与耐热相关性的待选类型。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
第一章文献综述  13-34
  第一节数量遗传学在水产育种方面的应用  13-23
    1.1 数量遗传学基础  13-14
    1.2 遗传力的估计  14-17
      1.2.1 遗传力的定义  14-15
      1.2.2 遗传力估计的方法  15-17
        1.2.2.1 亲子资料估计遗传力  15
        1.2.2.2 同胞资料估计遗传力  15-17
    1.3 选择育种  17-23
      1.3.1 选择育种的理论  17-18
      1.3.2 选择育种的基本方法  18-20
        1.3.2.1 群体选择  18
        1.3.2.2 家系选择  18-19
        1.3.2.3 家系内选择  19
        1.3.2.4 后裔鉴定  19-20
        1.3.2.5 合并选择  20
        1.3.2.6 多性状指数选择  20
      1.3.3 选择育种在鱼类中的研究进展  20-23
  第二节热休克蛋白70 研究进展  23-30
    2.1 热休克蛋白简介  23-24
    2.2 热休克蛋白的分类及分布  24-25
    2.3 热休克蛋白各家族的主要特点  25-28
      2.3.1 HSP90 家族  25
      2.3.2 HSP60 家族  25
      2.3.3 小分子HSP 家族  25-26
      2.3.4 HSP70 家族  26-28
        2.3.4.1 HSP70 家族简介  26
        2.3.4.2 Hsp70 的功能  26-28
    2.4 鱼类热休克蛋白70（HSP70）的研究进展  28-30
  第三节单核苷酸多态性（SNP）的概念及应用  30-33
    3.1 单核苷酸多态性概述  30-31
    3.2 SNP 的分型检测方法  31
    3.3 SNP 标记在鱼类中关联性分析的应用  31-33
  第四节本论文的研究目的、意义和方案  33-34
第二章牙鲆经过选育后的子代经济性状遗传分析  34-42
  1 材料与方法  34-36
    1.1 牙鲆家系的建立  34
    1.2 数据分析  34-36
  2. 结果  36-40
    2.1 牙鲆选育一代后的经济性状遗传进展结果  36-38
    2.2 牙鲆体重体长体高遗传力估计及显著性检验  38-40
  3 讨论  40-42
    3.1 选择育种  40
    3.2 遗传力的估计  40-42
第三章牙鲆 Hsp70 及 Hsc70 基因的克隆及表达分析  42-54
  1 材料和方法  42-45
    1.1 实验材料  42
    1.2 总RNA 的提取及纯化  42
      1.2.1 总RNA 的提取  42
      1.2.2 总RNA 的纯化（去除DNA）  42
    1.3 反转录（cDNA 的合成）  42-43
    1.4 牙鲆基因组DNA 的提取  43
    1.5 实验中所用引物  43
    1.6 HSP70 及HSC70 基因DNA 全长的获得  43-44
    1.8 牙鲆受热胁迫时hsp70 和hsc70 基因的表达差异  44-45
      1.8.1 样品cDNA 的合成及标准曲线的制作  44
      1.8.2 Real‐time?PCR 检测牙鲆受热胁迫时Hsp70 和Hsc70 基因的表达  44-45
      1.8.3 数据处理  45
  2 结果  45-51
    2.1 Hsp70 和Hsc70 基因DNA 序列的获得  45-50
      2.1.1 Hsp70 基因DNA 及cDNA 序列的获得  45-47
      2.1.2 Hsc70 cDNA 及DNA 序列的获得  47-48
      2.1.3 两者序列对比  48-50
    2.2 Hsp70 和Hsc70 基因在受热胁迫时的表达分析  50-51
  3 讨论  51-54
第四章 HSP70 的SNP 位点与牙鲆耐热性状的关联分析  54-64
  1. 材料和方法  54
    1.1 实验材料  54
    1.2 实验方法  54
  2 结果  54-62
    2.1 相对耐热性状群体的获得  54-57
    2.2 SNP 与耐热性状的筛查  57-60
    2.3 SNP 之间的连锁分析  60-61
    2.4 Haplotype 分析  61-62
  3. 讨论  62-64
参考文献  64-73
致谢  73
个人简历  73

牙鲆HSP70与HSC70基因的克隆、表达及其SNPs与耐热性状的相关性分析

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