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谢氏宽漠王热休克蛋白基因的克隆及表达

作　者: 唐婷
导　师: 任国栋；柳峰松
学　校: 河北大学
专　业: 动物学
关键词: 谢氏宽漠王 hsp70基因 hsc70基因 β-actin基因半定量RT-PCR 原核表达抗血清制备 Western Blot
分类号: Q51
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

谢氏宽漠王Mantichorula semenowi Reitter隶属于鞘翅目Coleoptera拟步甲科Tenebrionidae漠甲亚科Pimeliinae漠甲族Pimeliini宽漠王属Mantichorula Reitter,是分布在我国内蒙古阿拉善东部、宁夏中北部和蒙古国南缘的一个特有物种,其成虫能在沙表74℃的极端高温下活动并利用小生境繁衍生息,受环境胁迫形成了特殊的生理生态适应特征。了解谢氏宽漠王的热休克蛋白(heat shock protein,HSP)基因调控,研究其在恶劣环境下的生物抗逆机制在理论和应用上都有重要的意义。本论文以谢氏宽漠王为研究材料。研究内容主要分为3个部分：第1部分：通过RT-PCR及RACE技术从谢氏宽漠王体内克隆获得与昆虫抗高温机制相关的2种不同hsp70基因的cDNA序列,并对其核苷酸和编码的蛋白序列进行了生物信息学分析；第2部分：通过同源克隆得到谢氏宽漠王β-actin基因,检测了β-actin基因作为分子内标的可靠性,并建立了1种以在昆虫体内稳定表达的管家基因β-actin为分子内标的半定量RT-PCR方法。以此方法对热激条件下谢氏宽漠王体内Mshsp70、Mshsc70基因的mRNA表达水平进行相对定量研究；第3部分：构建了谢氏宽漠王Mshsp70基因的原核表达载体,并在大肠杆菌DE3体内进行诱导表达,并以纯化后的蛋白免疫家兔制备抗体。研究结果如下：(1)谢氏宽漠王Mshsp70基因cDNA序列2137 bp,编码区长1950 bp,5′端非翻译区为19 bp,3′端非翻译区为168 bp。可编码649个氨基酸残基,理论分子量为71.34 KD,同源性分析表明该基因与异色瓢虫Harmonia axyridis的核苷酸序列相似性高达85%,推导的氨基酸序列与赤拟谷盗Tribolium castaneum蛋白序列相似性达92%。(2)谢氏宽漠王Mshsc70基因cDNA序列1908 bp,编码区长1808 bp,3’UTR为100 bp。编码601个氨基酸残基。理论分子量为57.85 KD,同源性分析表明该基因的核苷酸序列和蛋白序列与赤拟谷盗的序列相似性分别为80%,85%。(3)谢氏宽漠王β-actin基因cDNA序列全长1372 bp,包含一个长度为1131 bp的开放阅读框,编码376个氨基酸。5′和3′末端非翻译区域(UTR)分别为66 bp和175bp；该数据与其他动物β-actin基因核苷酸序列具有96%～99%高度同源性。将该序列提交GenBank,获得序列号为EU825991。β-actin表达量检测结果显示热激后不同恢复时间其表达量无明显变化,且与未经热激处理的对照相比无显著差异,可以作为研究受外界环境胁迫作用下昆虫体内不同基因表达水平高低的可靠内部参照标准。(4)通过半定量RT-PCR分析：谢氏宽漠王在未经热处理的正常条件下,Mshsp70和Mshsc70均有表达,但是室温恢复过程中,2个基因具有截然不同的表达趋势。经42℃热激1 h后立即诱导Mshsp70表达至最高峰；在恢复到室温的1～4 h内Mshsp70表达量逐渐降低,但仍然高于未热激对照组。而Mshsc70在42℃热激1 h后表达受到抑制,但在恢复2～4 h内有少量的表达。(5)利用高效原核表达载体pET-DsbA,成功构建了谢氏宽漠王Mshsp70基因的原核表达载体,并在大肠杆菌DE3中37℃培养,IPTG终浓度为1 mM诱导3 h获得成功表达。SDS-PAGE蛋白电泳显示,融合蛋白分子量约为60 KD,目的条带与预期分子量一致。利用His亲和层析纯化得到融合蛋白,以纯化后的蛋白免疫家兔制备HSP70抗体,经过Western Blot检测到与预期大小一致的特异性条带。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-13
前言  13-15
1 文献综述  15-25
  1.1 热休克蛋白的研究进展  15-18
  1.2 热休克蛋白的分子结构特征与分类  18-19
  1.3 热休克基因及表达调控  19-21
    1.3.1 热激应答元件和热激因子  19
    1.3.2 热休克蛋白基因转录激活过程  19-20
    1.3.3 热休克蛋白基因转录后水平调控  20-21
  1.4 热休克蛋白的主要生物学功能  21-25
2 谢氏宽漠王Mshsp70和Mshsc70基因的克隆与序列分析  25-48
  2.1 研究材料  25-27
    2.1.1 实验材料  25
    2.1.2 实验仪器和试剂  25-26
    2.1.3 实验溶液及其配制  26-27
  2.2 研究方法  27-31
    2.2.1 总RNA提取  27
    2.2.2 反转录  27
    2.2.3 谢氏宽漠王Mshsp70和Mshsc70基因的克隆  27-30
      2.2.3.1 引物设计  27-28
      2.2.3.2 谢氏宽漠王Mshsp70和Mshsc70基因cDNA序列保守区域的扩增  28
      2.2.3.3 谢氏宽漠王Mshsp70和Mshsc70基因cDNA序列3′末端的扩增  28-29
      2.2.3.4 PCR产物琼脂糖电泳检测和回收纯化  29
      2.2.3.5 PCR纯化产物的克隆测序  29-30
    2.2.4 谢氏宽漠王Mshsp70和Mshsc70基因序列拼接和生物信息学分析  30-31
  2.3 结果与讨论  31-47
    2.3.1 总RNA的提取  31
    2.3.2 谢氏宽漠王Mshsp70和Mshsc70基因的克隆  31-32
    2.3.3 谢氏宽漠王Mshsp70和Mshsp70基因cDNA序列特征分析  32-47
      2.3.3.1 基因核苷酸序列基本分析  32-38
      2.3.3.2 蛋白质一级序列分析  38-39
      2.3.3.3 蛋白质功能基序分析  39-41
      2.3.3.4 蛋白质二级结构分析  41-44
      2.3.3.5 蛋白质三级结构分析  44-45
      2.3.3.6 分子进化分析  45-47
  2.4 讨论  47-48
3 谢氏宽漠王β-actin基因cDNA克隆及表达量检测  48-57
  3.1 引言  48
  3.2 谢氏宽漠王β-actin基因的克隆与序列分析  48-53
    3.2.1 研究材料  48
    3.2.2 研究方法  48-50
      3.2.2.1 总RNA提取和反转录  48-49
      3.2.2.2 谢氏宽漠王β-actin基因的克隆  49
      3.2.2.3 谢氏宽漠王β-actin基因序列拼接及同源性对比  49-50
    3.2.3 结果与讨论  50-53
      3.2.3.1 谢氏宽漠王β-actin基因的克隆  50
      3.2.3.2 谢氏宽漠王β-actin基因cDNA全长序列特征分析  50-52
      3.2.3.3 分子进化分析  52-53
  3.3 热激条件下β-actin基因mRNA水平表达量检测  53-57
    3.3.1 研究材料  53
    3.3.2 研究方法  53-54
      3.3.2.1 热激实验  53
      3.3.2.2 总RNA提取和反转录  53
      3.3.2.3 β-actin热激后表达量检测  53-54
    3.3.3 结果  54-55
    3.3.4 讨论  55-57
4 谢氏宽漠王Mshsp70和Mshsc70基因在热激条件下的表达分析  57-62
  4.1 研究材料  57
  4.2 研究方法  57-58
    4.2.1 热激实验  57
    4.2.2 总RNA提取和反转录  57
    4.2.3 Mshsp70和Mshsc70基因表达的半定量RT-PCR分析  57-58
  4.3 结果  58-60
  4.4 讨论  60-62
5 谢氏宽漠王Mshsp70基因的重组表达及鉴定  62-74
  5.1 研究材料  62-63
    5.1.1 菌株、昆虫来源  62
    5.1.2 主要仪器设备和实验试剂  62-63
  5.2 研究方法  63-68
    5.2.1 pET-DsbA/Mshsp70原核表达载体的构建  63-66
      5.2.1.1 Mshsp70片段的克隆  64-65
      5.2.1.2 pET-DsbA质粒的提取  65
      5.2.1.3 pET-DsbA质粒及Mshsp70片段的双酶切  65
      5.2.1.4 重组转化及鉴定  65-66
    5.2.2 Mshsp70融合蛋白的诱导表达  66-67
      5.2.2.1 诱导目的蛋白表达  66
      5.2.2.2 SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达  66-67
    5.2.3 表达产物的亲和纯化  67-68
      5.2.3.1 纯化蛋白PBS溶液配置方法  67
      5.2.3.2 纯化融合蛋白  67-68
    5.2.4 考马斯亮蓝染色法测定纯化蛋白浓度  68
    5.2.5 多克隆抗HSP70抗体的制备  68
    5.2.6 双向免疫扩散法测定效价  68
    5.2.7 Western Blot鉴定  68
      5.2.7.1 主要试剂配置  68
      5.2.7.2 转移蛋白质到硝酸纤维素膜上  68
      5.2.7.3 免疫印迹膜的处理  68
  5.3 结果  68-73
    5.3.1 pET-DsbA/Mshsp70载体Mshsp70 cDNA片段的克隆  68-69
    5.3.2 重组质粒鉴定  69
    5.3.3 重组融合蛋白HSP70的诱导表达  69
    5.3.4 融合蛋白HSP70的纯化  69-71
    5.3.5 抗血清制备及多克隆抗体效价测定  71-72
    5.3.6 Western Blot鉴定  72-73
  5.4 讨论  73-74
6 小结  74-75
参考文献  75-85
致谢  85-86
攻读学位期间取得的科研成果  86

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 蛋白质
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