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巴西固氮螺菌与吲哚乙酸（IAA）合成有关基因的克隆及功能分析

作　者: 谢宝恩
导　师: 陈三凤
学　校: 中国农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 吲哚-3-乙酸(IAA)合成 IAA突变株 巴西固氮螺菌 Tn5
分类号: Q785
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
下　载: 250次
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内容摘要


巴西固氮螺菌（Azospirillum brasilense）是一种能够促进草类和谷物生长的,具有固氮能力的根际促生长细菌。A.brasilense Yu62从北京郊区的玉米根际分离获得,在添加了色氨酸的培养基中能够合成超过50μg/ml的吲哚-3-乙酸（IAA）。为了更清楚的了解A.brasilense产IAA的合成机理,我们通过Tn5转座子诱变的方法获得了5,000多株具有卡那抗性的接合突变株,将这5,000多株突变株分别接种在MAZ培养基中摇瓶培养,用比色法和HPLC方法测定菌液中的IAA含量,得到了5个IAA产量降低的突变株。以转座子内的luxAB基因为探针进行Southern杂交,结果每个突变株都只有一条杂交带,证明这5个突变株都是Tn5单拷贝插入的突变体。 测序及同源性比较表明,在这5个IAA产量降低的突变株中,被插入失活的基因分别为编码GntR家族的转录调节因子的atrA基因、编码ABC型Fe3+转移系统中的离子结合蛋白的ftsA基因、编码外膜蛋白的omaA基因,编码醛脱氢酶的aldA基因及编码邻氨基苯甲酸合成酶组分Ⅰ的trpE基因。互补实验表明携带atrA、ftsA和omaA基因的广宿主载体可以不同程度的恢复相应突变株的IAA产量。另外还克隆了atrA下游的atrB和atrC基因,它们分别编码磷酸转移酶和氨基转移酶,atrA、artB和artC共同组成了一个基因簇,推测此基因簇参与催化吲哚丙酮酸途径中由色氨酸脱氨基生成吲哚丙酮酸的酶促反应。 通过同源重组的方法分别获得了artB和artC基因的卡那霉素抗性基因插入突变株,分析突变株的IAA产量发现,atrB基因失活后,IAA产量不变;当atrC基因失活后,IAA产量比atrA基因突变株的产量还要低。此结果表明,atrC基因参与了IAA合成。用原予吸收测定ftsA突变体和野生型培养液中的铁离子浓度表明,ftsA基因的编码产物与铁离子转运相关,同时表明Fe3+对IAA的合成有较大影响。通过测定omaA突变体和野生型胞内的IAA浓度,发现突变株的胞内IAA含量与野生型菌株胞内的IAA含量无显著差别,此结果表明,omaA基因对IAA产量的影响可能并非是因为破坏了IAA的分泌通道。trpE基因的突变导致了IAA产量的下降,并且可以通过在培养基中添加邻氨基苯甲酸恢复。与A.brasilense Sp7不同,Yu62中的trpE基因无形成色氨酸衰减子的前导序列,且不与trpG基因融合,推测在A.brasilense中可能存在两个拷贝的trpE基因。 通过PCR扩增的方法克隆了A.brasilense Yu62编码吲哚丙酮酸脱羧酶（IPDC）的ipdC基因,并将其克隆在广宿主载体pLAFR3上,获得了ipdC多拷贝的菌株。比较野生型及多拷贝菌株的IAA产量,二者没有明显差别。

全文目录


第一章 绪论  9-34
  1.1 植物根际细菌产吲哚-3-乙酸(IAA)研究进展  9-29
  1.2 细菌转座子Tn5转座机理的研究进展  29-33
  1.3 本论文研究路线与目标  33-34
第二章 A. brasilense Yu62产IAA突变株的转座子诱变与筛选  34-45
  2.1 材料与方法  34-42
  2.2 结果  42-44
  2.3 讨论  44-45
第三章 突变基因的序列测定及功能分析  45-85
  3.1 材料与方法  45-47
  3.2 结果  47-83
  3.3 讨论  83-85
第四章 突变基因的互补分析与功能研究  85-99
  4.1 材料与方法  85-88
  4.2 结果  88-96
  4.3 讨论  96-99
第五章 ipdC基因的克隆及多拷贝菌株的构建  99-105
  5.1 材料与方法  99-100
  5.2 结果  100-104
  5.3 讨论  104-105
结论  105-106
参考文献  106-119
致谢  119-120
作者简介  120

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程） > 转化及克隆
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