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细胞角蛋白8与NEMO/IKKγ的相互作用对NF-κB信号途径的影响

作　者: 姚景辉
导　师: 汪思应；杨晓明
学　校: 安徽医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: CK8 NEMO/IKKγ TRAF2 NF-κB 蛋白相互作用
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 138次
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内容摘要


NF-κB是一类具有多向转录调节作用的核蛋白因子,广泛存在于多种组织细胞中,激活后的NF-κB信号途径参与多种基因的转录调控,在免疫、炎症、氧化应激、细胞增殖、细胞凋亡、肿瘤形成等生理病理过程中发挥作用,对于该通路的研究具有十分重要的生物学意义。该通路的失调与多种人类疾病如肿瘤等的发生密切相关,特别在肝脏中,该信号通路的异常与肝炎、肝纤维化、肝硬化以及肝癌都有密切关系。IKK( Inhibitior of kappaB kinase)的活化是NF-κB激活信号通路中的关键步骤, IKK复合体包括两个高度同源的调节亚单位:IKK1/IKKα和IKK2/IKKβ,以及一个调节亚单位NEMO(Nuclear factor-Kappa B essential modulator)/IKKγ。为进一步研究NF-κB信号通路的精确调控机制,我们以NEMO为诱饵,用酵母双杂交技术从胎肝文库中分离到了与NEMO相互作用的蛋白质CK8 (cytokeratin8)。CK8(cytokeratin8, CK8)是碱性细胞角蛋白亚家族中的一员,属于细胞骨架蛋白家族,主要表达于上皮细胞和相关的肿瘤细胞中。参与维持细胞的机械完整性,还可以调节细胞黏附、细胞大小、蛋白质合成和细胞G1/S期的转变。本文以酵母双杂交筛选成人肝脏cDNA文库得到的未知相互作用对CK8和NEMO /IKKγ作为研究对象,通过一系列实验验证了二者的相互作用,并对其功能意义进行了初步探索。首先我们通过外源和内源性的免疫共沉淀实验,GST-pull down实验和免疫荧光共定位等实验确证了CK8和NEMO/ IKKγ之间存在生理性相互作用,免疫共沉淀实验表明,NEMO/ IKKγ(1-229aa)与CK8存在相互作用;CK8rod domain的ⅠB(139-235aa)和Ⅱ(253-402aa)两个亚单位与NEMO/IKKγ存在相互作用。随后我们通过转录活性实验发现,过表达CK8可以负调控NF-κB信号通路,并存在着剂量依赖效应,TNFα刺激后抑制作用更明显;CK8抑制TRAF2而不是TRAF6介导的NF-κB的活化;CK8抑制IKKα,IKKβ及IKKγ诱导的NF-κB的活化,这些说明CK8影响NF-κB活性的作用靶点是NEMO/ IKKγ。最后我们研究了CK8与NEMO/ IKKγ相互作用是如何负调控TRAF2介导的NF-κB信号通路的,我们发现CK8,TRAF2和NEMO/ IKKγ存在于同一个复合体中,通过体内泛素化实验我们发现过表达CK8可以抑制TRAF2和NEMO/ IKKγ的泛素化,并存在一定的剂量依赖关系,CK8可以增加NEMO/ IKKγ和IκBα的稳定性,抑制P65的入核,这些结果表明CK8抑制TRAF2的自身泛素化使其失活,从而抑制了NEMO/ IKKγ的泛素化而发挥负调控NF-κB信号通路的作用。我们又进一步检测发现CK8对NF-κB下游一些与抑制凋亡有关的靶基因的表达有明显的抑制作用,但其与凋亡的关系仍需进一步的研究。总之,我们筛选到的CK8和NEMO/ IKKγ相互作用能够影响NF-κB信号通路,此研究结果将有助于拓展对NF-κB信号通路调节机制的认识。

全文目录


主要英文缩略词  5-7
中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
主要仪器设备和常用试剂的配制  11-14
论文正文:细胞角蛋白8与NEMO/IKKγ相互作用的功能研究  14-48
  前言  14-18
  1、材料与方法  18-23
  2、结果与分析  23-45
  3、讨论  45-48
总结  48-49
参考文献  49-53
附录 综述  53-61
在读期间发表或投稿的论文  61-62
个人简历  62-63
致谢  63

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 病理学 > 病理生理学
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