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大黄鱼部分脂肪代谢相关基因的克隆及其表达分析

作　者: 周旋
导　师: 王志勇；姚翠鸾
学　校: 集美大学
专　业: 水产养殖学
关键词: 大黄鱼 PPAR LPL UCP2 Real-time PCR 组织表达鱼油
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

养殖环境的严重恶化等多种因素导致养殖大黄鱼肉质变差,已经成为影响大黄鱼养殖效益的重要因素,脂肪代谢相关基因其中包括过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptors,PPARs)基因在大黄鱼品质、风味的形成过程中具有重要作用。PPARs被脂肪酸以及它们的类花生酸代谢产物等配体激活,然后被激活的受体与视黄醇类X受体(Retinoid X receptor,RXR)结合成异源二聚体,然后结合与多种脂肪代谢相关酶的基因启动子区域的过氧化物酶体激活受体反应元件(Peroxisome proliferator response element,PPRE)结合从而调节其活动。其中受PPAR调控的基因包括脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase,LPL,EC3.1.1.34)基因、解偶联蛋白2(Uncoupling protein 2,UCP2)基因、肝型-脂肪酸结合蛋白(Liver-fatty acid binding protein,L-FABP)基因。本研究利用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆了大黄鱼PPARα、PPARβ、PPARγ、LPL、UCP2基因全长cDNA序列,研究了它们在大黄鱼不同组织的表达谱,并且扩增获得它们的部分基因组序列。结果表明:(1)大黄鱼PPARα基因cDNA全长1601bp,编码区长1437bp,编码的蛋白质含478个氨基酸,预测分子量53.3962kDa;大黄鱼PPARβ基因cDNA全长1759bp,编码区长1377bp,编码的蛋白质含458个氨基酸,预测分子量50.9559kDa;大黄鱼PPARγ基因cDNA全长1815bp,编码区1569bp,编码的蛋白质含522个氨基酸,预测分子量59.1071kDa;大黄鱼LPL基因cDNA全长1957bp,编码区长1545bp,编码的蛋白质含514个氨基酸,预测分子量58.1425kDa;大黄鱼UCP2基因cDNA全长1478bp,编码区长939bp,编码的蛋白质含312个氨基酸,预测分子量33.526kDa。(2)扩增得到了大黄鱼上述5个基因包含内含子的部分基因组序列,其中PPARα基因片段1307bp,包含4个外显子和3个内含子;PPARβ基因片段2986bp,含有6个外显子和5个内含子;PPARγ基因片段1133bp,包含了2个不完整的外显子和1个完整的内含子;LPL基因获得了2个片段,分别为2380bp和1402bp,各含有4个外显子和3个内含子;UCP2基因片段1473 bp,含有6个外显子和5个内含子。(3)采用Real time PCR技术研究了大黄鱼上述5个基因的组织表达谱,结果表明,PPARα、PPARβ、PPARγ基因在大部分组织都有表达,其中PPARα在肝脏中表达量最高,其次为心脏和脑;PPARβ基因在肝脏组织中表达量最高,其次为脑和性腺以及鳃组织;PPARγ基因也是在肝脏组织中表达量最高,其次为心脏和胃以及肠组织。大黄鱼LPL基因在检测的组织中都有表达,在肝脏中表达量最高,其次为肌肉。大黄鱼UCP2在心脏中表达量很高,在其它组织中表达量较低。(4)给大黄鱼饲喂含不同浓度鱼油的饲料后,对部分组织中LPL在转录水平上的表达变化分析结果表明:1)饲料中添加(0～8%)的鱼油的浓度越高,LPL在脑中的表达量越低。2)添加4%鱼油的饲料能降低大黄鱼肠中LPL的活性,添加8%鱼油的饲料能增强其LPL的表达量。3)喂养含鱼油的饲料的短暂的几天内大黄鱼肝脏LPL的活性都会显著升高,之后肝脏LPL的表达量呈下降趋势。4)4%和8%含量的鱼油饲料能增强大黄鱼肌肉LPL的表达量。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
第一章引言  10-19
  1.1 大黄鱼养殖现状  10
  1.2 研究背景  10-11
  1.3 鱼类部分脂肪代谢相关基因的研究进展  11-17
    1.3.1 过氧化物酶体增殖物激活受体  11-14
    1.3.2 脂蛋白脂肪酶  14-15
    1.3.3 解偶联蛋白  15-16
    1.3.4 脂肪酸结合蛋白  16-17
  1.4 本研究的目的和意义  17-18
  1.5 主要研究内容和技术路线  18-19
第二章大黄鱼部分脂肪代谢相关基因的全长CDNA 克隆及其表达分析  19-53
  2.1 材料与方法  19-27
    2.1.1 材料  19-22
    2.1.2 实验方法  22-27
  2.2 结果与分析  27-49
    2.2.1 总 RNA 提取结果  27
    2.2.2 各种脂肪代谢相关基因全长cDNA 的克隆  27-42
    2.2.3 组织表达结果分析  42-49
  2.3 讨论  49-53
    2.3.1 PPAR 基因  49-50
    2.3.2 LPL 基因  50-52
    2.3.3 UCP2 基因  52-53
第三章大黄鱼部分脂肪代谢相关基因部分基因组序列的扩增与分析  53-68
  3.1 材料  53-54
    3.1.1 实验材料  53
    3.1.2 实验试剂  53
    3.1.3 引物及其序列  53-54
    3.1.4 主要仪器  54
  3.2 实验方法  54-55
    3.2.1 基因组DNA 的提取  54
    3.2.2 基因组片段的扩增  54-55
    3.2.3 割胶纯化基因片段  55
    3.2.4 PCR 产物与pMD18-T 载体连接  55
    3.2.5 转化感受态细胞  55
    3.2.6 菌液 PCR 检测重组子  55
    3.2.7 序列分析  55
  3.3 结果与分析  55-65
    3.3.1 基因组 DNA 的提取结果  55
    3.3.2 PPAR 基因的扩增结果  55-61
    3.3.3 LPL 基因的扩增结果  61-64
    3.3.4 UCP2 基因的扩增结果  64-65
  3.4 讨论  65-68
    3.4.1 PPAR 基因  66
    3.4.2 LPL 基因  66-67
    3.4.3 UCP2 基因  67-68
结论  68-69
致谢  69-70
参考文献  70-76
在学期间发表的学术论文  76

大黄鱼部分脂肪代谢相关基因的克隆及其表达分析

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