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鲈鱼BHMT基因的cDNA克隆和组织表达

作　者: 宋娟娟
导　师: 钱云霞
学　校: 宁波大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 鲈鱼盐度 BHMT 克隆组织表达
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

BHMT(Betaine homocysteine methyltransferase),即甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶,是一种Zn2+依赖的巯基甲基转移酶。本实验通过PCR和RACE技术克隆了鲈鱼(Lateolabrax japonicus)BHMT基因全长,并对其进行了结构分析,通过RT-PCR方法检测了BHMT基因在鲈鱼各组织中的分布,同时利用RT-PCR和实时荧光定量PCR检测了盐度和甜菜碱对鲈鱼各组织中BHMT基因表达的影响,为今后研究BHMT功能及鱼类渗透压调节机制奠定基础。利用RT-PCR和SMART RACE的方法从鲈鱼肝脏中成功克隆了BHMT全长cDNA。该序列全长1461bp,5’端非翻译区1151bp,3’端非翻译区517bp,开放阅读框(ORF)1206bp,可编码一个由401个氨基酸残基组成的蛋白质,该蛋白质理论分子量为44.32kDa、等电点为7.21。氨基酸序列分析表明,BHMT基因具有较高的保守性,鲈鱼BHMT与黄鲈(Perca flavescens)、金头鲷(Sparus aurata)、大西洋鲑(Salmo salar)、斑马鱼(Danio rerio)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、人(Homo sapiens)、黑猩猩(Pan troglodytes)、小鼠(Mus musculus)、牛(Bos taurus)等十个物种的同源性为77%~93%,其中与黄鲈的同源性最高,为93%。BHMT具有Zn2+依赖的硫醇和硒醇甲基转移酶家族的结构特征,即具有G(ILV)NCX结构的基序A和具有(ALV)X(2)(LV)GGCCX(3)PX(2)I结构的基序B。利用RT-PCR法检测BHMT基因在鲈鱼肌、心、眼、脑、鳃、肝、肠、肾、脂、脾组织中的表达情况,结果表明该基因在鲈鱼肝、肠和肾三个组织中均有表达,其中肝脏组织的表达量最大。通过RT-PCR和实时荧光定量PCR的方法表明鲈鱼从盐度25的海水转入盐度12的海水后,肝、肠和肾BHMT基因表达量均有增加,而将鲈鱼从盐度为25的海水转入盐度为29的海水后,肝、肠和肾的BHMT基因表达量则减少。腹腔注射甜菜碱后,鲈鱼肝、肠和肾三个组织中的BHMT基因的相对表达量有显著的增加。结果表明,盐度刺激后对鲈鱼BHMT基因的表达量有显著影响,同时甜菜碱也可诱导鲈鱼BHMT基因的表达,说明BHMT在适应鱼类环境渗透压变化中起到重要的作用。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
引言  8-9
1 综述  9-18
  1.1 牛磺酸  9-11
    1.1.1 牛磺酸的生物学功能  9-10
    1.1.2 牛磺酸的合成  10
    1.1.3 牛磺酸转运  10-11
    1.1.4 牛磺酸在畜禽养殖中的应用  11
  1.2 肌醇  11-12
    1.2.1 肌醇对鱼类的作用  11-12
    1.2.2 肌醇的代谢  12
    1.2.3 肌醇的转运  12
  1.3 山梨醇  12-13
    1.3.1 山梨醇与渗透压的关系  12-13
    1.3.2 醛糖还原酶的活性  13
  1.4 甜菜碱  13-18
    1.4.1 甜菜碱与甲基供体  13-14
    1.4.2 甜菜碱与高半胱氨酸代谢及对血浆高半胱氨酸的影响  14
    1.4.3 影响甜菜碱转运的因素  14-15
    1.4.4 甜菜碱与渗透压的关系  15
    1.4.5 BHMT 与鱼类渗透压的关系  15-18
2 鲈鱼BHMT 基因全长cDNA 的克隆和组织表达  18-48
  2.1 实验材料和仪器  18-19
    2.1.1 实验材料  18
    2.1.2 实验中所用试剂盒  18
    2.1.3 其他主要试剂  18-19
    2.1.4 主要仪器  19
  2.2 实验方法  19-31
    2.2.1 RNA 的提取和肝脏常规cDNA 的合成  19-20
    2.2.2 鲈鱼BHMT 核心片段的获取  20-23
    2.2.3 3’Ready cDNA 的合成和5’Ready cDNA 的合成  23-27
    2.2.4 鲈鱼BHMT 基因cDNA 序列和蛋白质序列的分析  27
    2.2.5 盐度对鲈鱼BHMT 表达的影响  27-31
    2.2.6 甜菜碱对鲈鱼肝、肠和肾BHMT 基因表达的影响  31
  2.3 实验结果和分析  31-46
    2.3.1 鲈鱼BHMT 基因的序列分析  31-36
    2.3.2 鲈鱼BHMT 基因同源性比较和系统发育分析  36-37
    2.3.3 检测盐度对鲈鱼BHMT 表达的影响  37-45
    2.3.4 荧光定量PCR 检测甜菜碱对鲈鱼BHMT 基因表达的影响  45-46
  2.4 讨论  46-48
3 总结和展望  48-49
参考文献  49-56
缩略词  56-57
在学研究成果  57-58
致谢  58

鲈鱼BHMT基因的cDNA克隆和组织表达

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