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借助远缘杂交构建大黄鱼微卫星标记连锁图谱

作　者: 武祥伟
导　师: 王志勇
学　校: 集美大学
专　业: 水产养殖
关键词: 大黄鱼微卫星连锁图谱着丝粒 M13-tailed 基因组扩增远缘杂交
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

本文建立了大黄鱼与黄姑鱼杂交鱼苗的基因组DNA扩增技术,以及通用序列加尾与荧光素标记的微卫星分型技术。利用所建立的技术,以大黄鱼♀×黄姑鱼♂和大黄鱼♂×黄姑鱼♀杂交初孵仔鱼为材料构建微卫星标记连锁图谱,同时利用诱导的杂交三倍体研究了32个大黄鱼Ⅰ型微卫星标记与着丝粒的遗传距离。主要结果如下:1.为实现利用Gel-Scan 3000遗传分析仪准确、自动地记录微卫星标记电泳产物并节省成本,研究了以添加荧光标记的M13引物为通用引物的微卫星标记分析技术。其PCR体系包含3条引物:5’端加上M13通用序列的正向引物、反向引物与M13引物(5’端标记一种荧光素),正向与反向引物用量之比为1:10,且正向引物与M13引物用量之和等于反向引物用量时扩增效果最好。研究确定了适用于大黄鱼已有微卫星标记的PCR反应体系、热循环条件,以及多重上样方法。与普通PCR及银染显色技术相比,该方法具有高通量、低成本以及分析精确等优点。2.鉴于大黄鱼与黄姑鱼杂交能获得拥有父本和母本单倍体基因组且形态正常的杂交仔鱼,但仔鱼不能开口摄食和成长,DNA数量不足以用于遗传图谱构建,因此研究了杂交仔鱼的DNA扩增技术。基因组DNA以TaqⅠ内切酶酶切,酶切片段与TaqⅠ寡核苷酸接头连接,然后以该接头序列为引物用高保真DNA聚合酶对连接产物进行PCR扩增。采用这种方法,可使基因组DNA增加约2.5×107倍,大部分扩增片段集中在500-1500 bp之间,用作大黄鱼微卫星标记连锁图谱构建的PCR反应模板效果良好,从而解决了用初孵仔鱼构建遗传图谱DNA模板不足的问题。3.采用纯粹的大黄鱼家系构建遗传图谱,由于亲本间的遗传差异不大,在很多微卫星位点上都缺乏作图信息,构建高密度图谱有困难。因此本文尝试利用大黄鱼与黄姑鱼杂交子代进行大黄鱼遗传图谱构建,以期能够对利用纯粹的大黄鱼家系构建的SSR标记图谱进行加密。共使用144尾大黄鱼♀×黄姑鱼♂家系、96尾黄姑鱼♀×大黄鱼♂家系的初孵仔鱼,主要选择在纯粹的大黄鱼家系中缺乏作图信息的位点,加上部分已在本实验室构建的大黄鱼SSR标记图谱上定位的位点作为锚定标记,共检测了221个标记,正反交家系中具作图信息的标记分别有81个与61个,能定位到雌雄图谱中的标记分别有43个与30个,分别构成15个与11个连锁群。构成的雌性图谱总长度529.17 cM,预期长度1138.96 cM,图谱覆盖率为46.4%;雄性图谱总长度327.56 cM,预期长度614.48 cM,图谱覆盖率为53.3%。雌雄图谱中偏离1:1分离比的位点分别有5个与7个,占总标记的6.1%与11.7%。32个微卫星标记可在黄姑鱼基因组中扩增出清晰的条带,其中14个具有多态性。4.进行大黄鱼与黄姑鱼杂交,通过抑制受精卵第二极体排出,构建了2个三倍体家系;利用这2个家系研究了32个大黄鱼Ⅰ型微卫星标记与着丝粒间遗传距离。其中21个位点的重组率大于2/3,说明这些位点处于与着丝粒距离较远的位置,位点LYC1737与着丝粒重组率达0.979,显示其可能位于远离着丝粒的染色体的端部区域;LYC3211与着丝粒重组率为0,表明位置紧邻着丝粒。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
第1章引言  11-41
  1.1 微卫星标记介绍  11-18
    1.1.1 微卫星标记概述  11-12
    1.1.2 微卫星序列的形成机制  12
    1.1.3 微卫星标记的筛选方法  12-16
    1.1.4 微卫星标记的评价  16-17
    1.1.5 微卫星标记的应用  17-18
  1.2 基因组扩增  18-27
    1.2.1 基因组扩增概述  18-19
    1.2.2 基因组扩增方法  19-27
    1.2.3 不同基因组扩增方法评价  27
  1.3 遗传连锁图谱构建  27-31
    1.3.1 遗传连锁图谱构建的理论基础  27-28
    1.3.2 双向假测交法作图  28
    1.3.3 遗传连锁图谱构建步骤  28-31
  1.4 遗传连锁图谱的应用及鱼类遗传连锁图谱的研究概况  31-34
    1.4.1 遗传连锁图谱的应用  31-32
    1.4.2 鱼类中连锁图谱的研究概况  32-34
  1.5 大黄鱼遗传育种研究概况  34-39
    1.5.1 大黄鱼资源现状及存在的问题  34
    1.5.2 大黄鱼资源研究及遗传育种研究概况  34-39
  1.6 本研究的内容、目的及意义  39-41
第2章应用通用荧光引物进行大黄鱼微卫星标记分型  41-53
  2.1 材料与方法  42-47
    2.1.1 材料的构建与采集  42
    2.1.2 试剂与仪器  42-44
    2.1.3 基因组DNA 抽提  44-45
    2.1.4 引物设计  45
    2.1.5 PCR 条件摸索及优化  45-46
    2.1.6 扩增产物的电泳分析  46-47
  2.2 结果  47-49
    2.2.1 PCR 条件的优化  47-48
    2.2.2 多重上样电泳的效果  48
    2.2.3 ONE-Dscan 软件分析电泳图谱  48-49
  2.3 讨论  49-53
    2.3.1 用通用荧光引物进行微卫星位点扩增的影响因素  49-50
    2.3.2 多重上样策略  50
    2.3.3 ONE-Dscan 软件分析电泳图谱  50-53
第3章基因组扩增技术的建立  53-65
  3.1 材料与方法  53-57
    3.1.1 实验材料  53
    3.1.2 试剂与仪器  53-54
    3.1.3 实验方法  54-56
    3.1.4 基因组扩增验证  56
    3.1.5 基因组扩增体系稳定性检测  56
    3.1.6 基因组扩增在微卫星遗传连锁图谱构建上的应用  56-57
  3.2 结果  57-62
    3.2.1 大黄鱼基因组DNA 的抽提效果  57-58
    3.2.2 基因组酶切及连接  58
    3.2.3 基因组DNA 的扩增  58-59
    3.2.4 扩增的验证  59-60
    3.2.5 基因组DNA 扩增后的应用效果  60-62
  3.3 讨论  62-65
    3.3.1 基因组扩增的方法  62-63
    3.3.2 基因组DNA 扩增的拷贝数  63
    3.3.3 基因组扩增的突变率  63-64
    3.3.4 微卫星标记的扩增  64-65
第4章大黄鱼遗传连锁图谱的构建  65-78
  4.1 创建作图群体  66-67
    4.1.1 作图群体创建过程  66
    4.1.2 样品的采集  66
    4.1.3 基因组DNA 的抽提  66-67
  4.2 微卫星标记的筛选  67-68
    4.2.1 材料与方法  67
    4.2.2 结果  67-68
  4.3 遗传连锁图谱的构建  68-74
    4.3.1 材料和方法  68-69
    4.3.2 结果  69-74
  4.4 讨论  74-78
    4.4.1 作图策略  74-76
    4.4.2 大黄鱼遗传连锁图谱的长度、覆盖率及标记的分布  76
    4.4.3 偏分离标记  76-77
    4.4.4 黄姑鱼中标记分布  77-78
第5章大黄鱼微卫星标记-着丝粒作图  78-87
  5.1 材料与方法  78-79
    5.1.1 主要试剂与仪器  78
    5.1.2 大黄鱼与黄姑鱼杂交三倍体家系的建立  78-79
    5.1.3 作图材料的采集与DNA 抽提  79
    5.1.4 微卫星位点扩增、检测及作图标记筛选  79
    5.1.5 数据统计与分析方法  79
  5.2 结果  79-84
    5.2.1 基因组DNA 抽提效果  79
    5.2.2 作图微卫星标记的筛选  79-82
    5.2.3 微卫星标记与着丝粒间的遗传距离  82-84
  5.3 讨论  84-87
    5.3.1 作图群体类型与大小  84-85
    5.3.2 微卫星标记-着丝粒间的遗传距离  85-87
第6章结语与展望  87-89
  6.1 研究结论  87-88
  6.2 本研究的创新点  88
  6.3 展望  88-89
致谢  89-90
参考文献  90-103
附录  103-108
在学期间发表的学术论文  108

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