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小鼠Flt3L基因克隆与表达纯化及其生物学活性鉴定

作　者: 熊阿莉
导　师: 方敏；龚非力
学　校: 华中科技大学
专　业: 免疫学
关键词: Flt3L 原核表达 蛋白纯化 浆细胞样树突状细胞
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 7次
引　用: 0次
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内容摘要


目的:获得小鼠Flt3L（FL）序列,构建表达小鼠FL蛋白的原核表达载体PGEX-4T3/mFL,并诱导其表达、纯化及鉴定其生物学活性。方法:提取C57BL/6小鼠脾脏总RNA,逆转录成cDNA,采用小鼠FL序列特异性引物PCR扩增FL cDNA,构建重组质粒PGEX-4T3/mFL。经PCR、酶切和测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行诱导表达。GST亲和层析方法纯化目的蛋白并进行SDS-PAGE检测。通过体外培养pDC的方法检测其生物学活性。结果:1、经测序证实,获得的目的基因与GenBank公布的小鼠Flt3L基因序列（NM013520.3）的同源性为99%一致,仅第688位碱基不同。NM013520.3序列该处碱基为T,克隆序列为C。但两个序列中,该碱基对应的密码子所编码的氨基酸均为脯氨酸,属于同义突变。2、构建的原核表达载体PGEX-4T3/FL在大肠杆菌BL21中经I P T G诱导后表达出相对分子质量为52 0 0 0的蛋白,经GST柱纯化后进行SDS-PAGE在相对分子质量为52 0 0 0处可见目的蛋白带,与mF L的预期蛋白分子量相符。3、体外培养pDC表明,表达的mFL能有效促进PDC的产生。结论:成功克隆小鼠Flt3L基因,构建了其原核表达载体PGEX-4T3/FL,并成功诱导了mFL蛋白的表达,表达的mFL蛋白具有生物学活性。为下一步细胞、动物实验以及大规模生产奠定了基础。

全文目录


主要缩略词表  5-6
中文摘要  6-7
英文摘要  7-9
前言  9-11
引言  11
材料和方法  11-26
实验结果  26-32
讨论  32-33
结论  33-34
参考文献  34-36
综述  36-46
  参考文献  42-46
致谢  46

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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