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狼疮性肾炎肾阴虚证DNA消减文库的构建

作　者: 付婷婷
导　师: 罗仁
学　校: 第一军医大学
专　业: 中西医结合内科学
关键词: 狼疮性肾炎肾阴虚证抑制性消减杂交基因克隆
分类号: R259
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 56次
引　用: 1次
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内容摘要

目的:建立抑制性消减杂交方法以筛选人白细胞中的差异基因,并检验其筛选效能。构建狼疮性肾炎肾阴虚证DNA消减文库。方法:首先参照Akopyants等方法建立抑制性消减杂交法以筛选人血白细胞中人基因组的差异基因,并检验其筛选效能:选健康的汉族人抽取静脉血(抗凝)2ml,提取白细胞基因组DNA。将DNA分为两份,其中一份加入10ng质粒pUCm-T作为实验方(Tester),此经Rsa Ⅰ酶切的质粒pUCm-T DNA片段作为所要筛选的差异基因。然后从狼疮性肾炎肾阴虚证入手,按美国风湿病协会1982年系统性红斑狼疮诊断标准,选取汉族人确诊为系统性红斑狼疮患者,狼疮患者有下列任一项肾受累表现者即可诊断为狼疮肾炎:1、蛋白尿>0.5g/24hr;2、血尿RB C>5个HPF离心尿3、肾功能下降;4、肾小管功能异常;5、肾活检异常。确诊为狼疮性肾炎患者,依据肾虚证诊断标准,辨证为肾阴虚证患者,应用现代分子生物学技术—抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、基因克隆(gene clone)等方法构建狼疮性肾炎肾阴虚证的正、反向DNA消减文库,再运用斑点杂交原理(dot blot)去除假阳性克隆,从而构建狼疮性肾炎肾虚证DNA消减文库。随机抽取阳性克隆进行测序,测序后使用以下基因库http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/进行序列的同源性分析以验证该文库是否含有基因片段。结果:本实验成功将经Rsa Ⅰ酶切的质粒pUCm-T DNA片段筛选出来,说明建立的筛选复杂基因组中差异基因的SSH方法是成功的,可用于构建狼疮性肾炎肾阴虚证DNA消减文库。首次成功地构建了汉族人LN肾阴虚证的DNA

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-8
引言  8-12
第一部分筛选差异基因抑制性消减杂交方法的建立  12-25
  (一) 材料  12-15
  (二) 方法  15-18
  (三) 结果  18-19
  (四) 讨论  19-25
第二部分狼疮性肾炎肾阴虚证DNA消减文库的构建  25-36
  (一) 材料  25-26
  (二) 方法  26-32
  (三) 结果  32-34
  (四) 讨论  34-36
第三部分狼疮性肾炎肾阴虚证DNA消减文库的初步验证  36-42
  (一) 材料  36-37
  (二) 方法  37-39
  (三) 结果  39-40
  (四) 讨论  40-42
全文小结  42-43
参考文献  43-46
成果  46-47
致谢  47-48
原创声明  48

狼疮性肾炎肾阴虚证DNA消减文库的构建

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