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桑粒肩天牛幼虫肠道优势菌群研究及Cry3A重组质粒载体构建

作　者: 冯霞
导　师: 殷幼平
学　校: 重庆大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 桑粒肩天牛幼虫肠道优势菌群 16S rRNA GFP 标记基因 Cry3A 基因重组质粒载体
分类号: S763.38
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

天牛是鞘翅目昆虫中一个很大的类群,其幼虫大多以木质纤维为食。因为天牛危害,林木受害率达20-90%,每年经济损失上亿元。而传统的天牛防治方法费时、费工、成本又高,有的还对环境有严重污染。因此,探索新的防治途径,开发新的防治技术,已成为生产上的迫切要求。新的害虫防治方法和理论完善与发展离不开昆虫生理生化的研究。近年来,研究昆虫肠道正常菌群和肠道微生态以探索新的害虫控制方法正在成为国内外研究的热点之一。本文用传统培养方法和现代分子生物学方法-16S rRNA分析法对桑粒肩天牛幼虫肠道微生物组成进行了研究。同时本文还构建了含有GFP 标记基因的Cry3A基因重组质粒载体,并将此载体转入桑粒肩天牛幼虫肠道优势菌群,以期通过GFP标记基因表达绿色荧光蛋白而研究优势菌群在桑粒肩天牛幼虫肠道内的定植以及Cry3A 基因在桑粒肩天牛幼虫肠道内的表达。进而研究Cry3A 表达的毒蛋白对天牛生长发育的影响,为新型转基因生物农药的研发提供理论依据与技术支撑。主要研究结果如下: (1) 用传统的培养方法共分离出28 种细菌,经鉴定为9 个不同的属,由分离率和肠道菌群的数量统计可得天牛肠道优势菌群是葡萄球菌属(Staphylococcus),其菌量为7.84±0.61,分离率为100%;其次是肠杆菌属(Enterobacter),其菌量为7.42±0.23,分离率也为100%。其它细菌分离率较低,依次是克雷伯氏菌属(Klebsiella)、链球菌属(Streptococcus)、变形杆菌属(Proteus)、沙雷氏菌属(Serratia)、埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、微球菌属(Micrococcus)。(2) 将传统方法从桑粒肩天牛幼虫肠道分离、鉴定的9 个不同属的细菌作为PCR 模板,进行16S rRNA 序列分析。研究结果表明这9 个不同属的细菌分别是葡萄球菌属(Staphylococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、链球菌属(Streptococcus)、变形杆菌属(Proteus)、沙雷氏菌属(Serratia)、埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)和微球菌属(Micrococcus),与分离培养方法所获得的结果一致。所测序列与BLAST 中的16S rRNA 序列相似性分别为98.78%、99.02%、98.86%、97.89%、99.24%、98.99%、98.44%、86.67%、99.18%(第一对引物);99.23%、99.34%、99.64%、98.35%、99.87%、99.08%、99.16%、99.32%、99.29%(第二对引物)。(3) 用16S rRNA 序列分析法研究结果表明桑粒肩天牛幼虫肠道微生物优势菌群为葡萄球菌属(Staphylococcus),其次为肠杆菌属(Enterobacter)。它们的16S

全文目录

中文摘要  4-6
英文摘要  6-10
1 绪论  10-25
  1.1 立题依据  10-11
  1.2 国内外研究现状  11-21
  1.3 研究目的  21-22
  1.4 研究内容和技术路线  22-24
  1.5 本研究的创新点  24-25
2 材料和方法  25-36
  2.1 供试菌株与昆虫  25
  2.2 培养基  25
  2.3 主要仪器  25-26
  2.4 主要试剂  26-28
  2.5 桑粒肩天牛幼虫肠道微生物传统的分离、纯化、鉴定  28
    2.5.1 肠道微生物样品制备  28
    2.5.2 肠道微生物的分离、纯化  28
    2.5.3 生理生化测试鉴定  28
  2.6 分子生物学方法研究桑粒肩天牛幼虫肠道微生物群落  28-33
    2.6.1 PCR 模板制备  28-29
    2.6.2 PCR 扩增反应体系及反应程序  29-31
    2.6.3 扩增片段的检测及变性聚丙烯酰胺凝胶分离  31
    2.6.4 分离片段的克隆、测序与分析  31-33
  2.7 重组质粒构建  33-35
    2.7.1 供试菌株  33
    2.7.2 苏云金芽胞杆菌质粒的提取(碱法小量提取)  33
    2.7.3 特异引物设计与Cry3A 基因的PCR 扩增  33-34
    2.7.4 GFP 标记基因与Cry3A 基因的连接  34-35
  2.8 转基因工程菌的构建与表达检测  35-36
    2.8.1 转基因工程菌的构建  35
    2.8.2 重组基因表达检测  35-36
3 结果  36-48
  3.1 桑天牛幼虫肠道可培养微生物  36-37
    3.1.1 桑天牛幼虫肠道可培养菌群的种类和菌量.  36
    3.1.2 桑天牛幼虫肠道的优势菌群  36-37
  3.2 桑粒肩天牛幼虫肠道优势菌群分子生物学方法验证  37-40
    3.2.1 肠道微生物16S rDNA 片段的扩增获得  37-38
    3.2.2 不同菌群16S rDNA 片段的聚丙稀酰胺凝胶电泳分离  38
    3.2.3 肠道菌群的16S rDNA 片段测序与分析  38-40
  3.3 杀虫晶体毒蛋白基因的提取  40-42
    3.3.1 苏云金芽胞杆菌质粒的提取  40
    3.3.2 优化的PCR 扩增杀虫晶体毒蛋白基因(Cry3A 基因)反应体系和反应程序  40-41
    3.3.3 杀虫晶体毒蛋白基因(Cry3A 基因)的获得  41-42
  3.4 含GFP 标记基因的Cry3A 基因重组质粒载体的构建  42-46
    3.4.1 含GFP 标记基因的PDHG5.2 质粒的提取  42-43
    3.4.2 Cry3A-GFP 重组基因片段的获得  43-44
    3.4.3 将Cry3A-GFP 基因片段插入3105 质粒载体  44-45
    3.4.4 重组质粒载体的检测  45-46
  3.5 含Cry3A-GFP 基因片段的重组质粒载体的荧光表达检测  46
  3.6 携带Cry 基因的3105 质粒和827-304 质粒在肠杆菌和葡萄球菌中的表达  46-48
4 讨论  48-53
  4.1 桑粒肩天牛幼虫肠道的优势菌群  48
  4.2 不同生长环境、不同季节对桑粒肩天牛幼虫肠道菌群的影响  48-49
  4.3 传统分离、纯化、鉴定方法是16S rRNA 序列分析微生物多样性不可或缺的补充  49-50
  4.4 应用16S rRNA 序列分析法研究昆虫肠道微生物对模板制备的要求  50-52
  4.5 重组质粒载体转化子的表达分析  52-53
5 结论与展望  53-55
致谢  55-56
参考文献  56-61
附录:  61-62
  1. 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目  61
  2. 作者在攻读硕士学位期间发表的论文  61-62
独创性声明  62
学位论文版权使用授权书  62

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