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海绵共生微生物氮循环功能基因与微生物种群多样性研究

作　者: 韩敏奇
导　师: 李志勇
学　校: 上海交通大学
专　业: 生物工程
关键词: 海绵 原核微生物共生体 16S rRNA基因 系统发育分析 丰度 硝化 反硝化 amoA nirS nirK
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


从中国南海海绵Phakellia fusca分离出越来越多的天然产物,但其中微生物的组成还知之甚少。另一方面,对海绵微生物群落的定量研究还几乎没有。本研究中,主要以原核微生物16S rRNA基因为标记,通过克隆文库和实时荧光定量PCR方法对海绵Phakellia fusca原核微生物组成进行了全面的研究。而氨氧化类群则通过amoA基因和厌氧氨氧化细菌特异性16S rRNA基因作为标靶来研究。海绵Phakellia fusca中细菌的组成为Gamma-变形菌(78%),Alpha-变形菌(7%)和Delta-变形菌(3%),以及蓝细菌(12%)。海绵Phakellia fusca中放线菌的多样性较好,由棒杆菌(48%),酸微菌(22%),弗兰克氏菌(15%),微球菌(13%)和链孢囊菌(2%)组成。而所有在海绵Phakellia fusca中发现的古菌都属于泉古菌。检测到的氨氧化类群微生物只有氨氧化古菌(AOA)。之后,对发现的微生物类群进行定量分析,最多的是细菌,第二的是古菌,再紧随其后的是放线菌。本研究拓展了海绵Phakellia fusca中微生物组成、丰度和生态学作用的信息。同时,对海绵共附生微生物可培养性和天然产物的研究也有帮助。海绵中生活着复杂、丰富的微生物,但这些微生物在氮循环中所起的作用还知道得不多,特别是海绵中的氨氧化细菌和反硝化过程。本研究中,调查了七种海绵中氮循环功能基因(amoA,nifH,nxrA,nirS和nirK)还有厌氧氨氧化细菌(AnAOB)和亚硝酸盐氧化细菌(NOB)。通过细菌amoA基因,在五种海绵中找到了氨氧化细菌(AOB),包括Haliclona sp.,Lamellomorpha sp.,Placospongia sp.,Acanthella sp.和Pericharax heteroraphis。除此之外,还在四种海绵中找到了氨氧化古菌,包括Haliclona sp.,Lamellomorpha sp.,Spirastrellidae diplastrella和Mycale fibrexilis。同时,对这四种海绵中的古菌多样性进行了研究。特别是,在海绵Placospongia sp.,Acanthella sp.和Pericharax heteroraphis中,只发现了氨氧化细菌。这表明氨氧化细菌是这些海绵中主要的氨氧化提供者。另外,亚硝酸盐还原酶nirS基因只在海绵Spirastrellidae diplastrella中被发现,而nirK基因只在海绵Lamellomorpha sp.中被发现。对氨单加氧化酶和亚硝酸盐还原酶的系统发育研究,表明有大量的海绵共生微生物参与到氨氧化和反硝化的过程中,特别是一些细菌的参与者。大量序列的最相似序列都是未培养的,可能是一些在海绵中较新的序列,而nirK基因则是首次在海绵中被发现。同时,还有少量功能基因序列具有海绵特异性。总之,本研究增加了海绵内微生物参与到复杂氮循环的知识。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
第一章 绪论  10-25
  1.1 海绵  10-14
    1.1.1 海绵动物简介  10-12
    1.1.2 海绵天然产物  12-14
  1.2 海绵共附生微生物  14-21
    1.2.1 海绵共附生微生物的可培养性  14-15
    1.2.2 海绵共附生微生物的多样性  15-17
      1.2.2.1 海绵共生微生物的垂直遗传  17
    1.2.3 海绵共附生微生物的分子研究手段  17-21
  1.3 海绵特定微生物类群的研究  21-24
    1.3.1 海绵功能基因的研究现状  21-22
    1.3.2 海绵氮循环微生物的研究  22-24
  1.4 研究目的、内容、意义  24-25
    1.4.1 研究目的  24
    1.4.2 研究内容  24
    1.4.3 研究意义  24
    1.4.4 创新点  24-25
第二章 PHAKELLIA FUSCA 共附生微生物多样性及定量分析  25-43
  2.1 实验材料  25-26
  2.2 实验方法  26-31
    2.2.1 海绵总DNA 的提取  26
    2.2.2 目标产物的PCR 扩增及克隆文库的构建  26-29
    2.2.3 系统发育分析  29-30
    2.2.4 实时荧光定量PCR  30-31
  2.3 实验结果  31-41
    2.3.1 海绵Phakellia fusca 总DNA 提取  31-32
    2.3.2 目标片断PCR 扩增结果  32
    2.3.3 海绵Phakellia fusca 共附生原核微生物多样性  32-38
    2.3.4 海绵Phakellia fusca 共附生氨氧化微生物多样性  38-40
    2.3.5 海绵Phakellia fusca 共附生微生物定量分析  40-41
  2.4 讨论  41-42
  2.5 本章小结  42-43
第三章 海绵氮循环微生物多样性的系统发育分析  43-64
  3.1 实验材料  43
  3.2 实验方法  43-46
    3.2.1 海绵总DNA 的提取  43
    3.2.2 目标产物的PCR 扩增及克隆文库的构建  43-45
    3.2.3 系统发育分析  45-46
  3.3 实验结果  46-61
    3.3.1 海绵总DNA 提取  46
    3.3.2 目标片断PCR 扩增结果  46-47
    3.3.3 七种海绵氮循环微生物多样性  47-61
  3.4 讨论  61-62
  3.5 本章小结  62-64
第四章 四种海绵中古菌多样性的分析  64-72
  4.1 实验材料  64
  4.2 实验方法  64-65
    4.2.1 海绵总DNA 的提取  64
    4.2.2 目标产物的PCR 扩增及克隆文库的构建  64-65
    4.2.3 系统发育分析  65
  4.3 实验结果  65-70
    4.3.1 目标片断PCR 扩增结果  65
    4.3.2 四种海绵中古菌的多样性  65-67
    4.3.3 四种海绵中古菌的系统发育分析  67-70
  4.4 讨论  70
  4.5 本章小结  70-72
第五章 结语  72-74
  5.1 展望  73-74
参考文献  74-84
附录1.溶液试剂及培养基  84-87
附录2.实验所用仪器设备  87-88
附录3.海绵PHAKELLIA FUSCA 共附生微生物序列  88-108
附录4.海绵氮循环微生物功能基因序列  108-131
附录5.海绵共附生古菌16S RRNA 部分长度序列  131-135
致谢  135-136
待发表论文  136-138

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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