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传染性法氏囊病病毒山东株的分离鉴定及其鸡胚毒的免疫效果

作　者: 李建亮
导　师: 崔言顺
学　校: 山东农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 传染性法氏囊病病毒分离鉴定母源抗体免疫保护
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

传染性法氏囊病(Infectious bursal disease, IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus, IBDV)引起的鸡和火鸡的一种急性、高度接触性传染病。该病除直接引起鸡死亡和生产性能下降外,还可导致感染鸡免疫抑制。特别是变异株IBDV、超强毒株IBDV(very virulentIBDV, vvIBDV)的出现,它们能够突破母源抗体的保护,引起高母源抗体的雏鸡发病并且有发病日龄提前的趋势,引起更大的经济损失。鉴于此,研制能够突破母源抗体,而不引起免疫抑制,对鸡没有致病性或致病性很弱的且能诱导良好免疫应答的疫苗十分必要。为实现这一目标,本课题共进行了以下4个试验: 试验1中,从山东省某疑似感染IBDV的鸡场分离到1株IBDV野毒,并就其对SPF鸡的致病性进行了研究。以0.05mL的1∶5法氏囊病料悬液接种15只28日龄SPF鸡,导致了100%的发病率和40%的致死率,表明毒株致病性较强,暂将其命名为IBDV SD0306。试验2中,对IBDV SD0306的VP2基因高变区进行了克隆与序列分析。利用Trizol试剂提取IBDV的核酸后,再以IBDV特异性引物,通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增,得到分离株IBDV VP2基因高变区的cDNA,构建了VP2基因高变区的重组质粒,将VP2基因高变区成功地克隆进pMD18-T载体中。序列分析表明,分离毒的cDNA序列同超强毒株HK46具有较高的同源性,而与经典强毒CJ801、疫苗株D78及变异株Var-E的同源性较低。试验3中,对IBDV SD 0306第11代鸡胚传代毒(E11)、第15代鸡胚传代毒(E15)进行了致病性的研究及VP2高变区基因序列的测定。将

全文目录

一、中文摘要  8-10
二、英文摘要  10-12
三、缩略语英汉对照表  12-13
四、引言  13-24
  1．1 概述  13
  1．2 IBDV的病原特性  13-14
  1．3 流行病学  14-16
    1．3．1 自然宿主  14-15
    1．3．2 传播媒介  15
    1．3．3 潜伏期和症状  15-16
    1．3．4 发病率和死亡率  16
  1．4 血清型  16
  1．5 IBDV的抵抗力  16-17
  1．6 致病机理  17-18
  1．7 免疫抑制  18
  1．8 VP2蛋白及其功能  18-20
  1．9 IBDV的变异  20-21
  1．10 诊断  21
  1．11 预防与控制  21-24
五、研究内容  24-57
  试验一 IBDV野毒株的分离鉴定  24-28
    1 材料和方法  24-25
      1．1 IBDV原始病料  24
      1．2 IBDV琼脂免疫扩散试验(AGID)标准抗原及血清  24
      1．3 SPF鸡胚和SPF鸡  24
      1．4 免疫胶体金试纸膜  24
      1．5 病毒的处理  24
      1．6 病毒的分离  24-25
      1．7 琼脂免疫扩散试验  25
        1．7．1 琼脂板的制备  25
        1．7．2 琼脂免疫扩散试验步骤  25
      1．8 免疫胶体金试纸膜检测IBDV  25
      1．9 分离株致病性的测定  25
      1．10 病理组织学观察  25
    2 结果  25-27
      2．1 发病鸡的临床症状及流行病学  25-26
      2．2 病毒分离结果  26
      2．3 琼脂扩散试验  26
      2．4 免疫胶体金试纸膜检测结果  26
      2．5 动物回归试验结果  26
      2．6 组织病理学观察  26-27
    3 讨论  27-28
  实验二 IBDV SD0306 VP2基因高变区的克隆与序列分析  28-42
    1 材料  28-29
      1．1 病毒  28
      1．2 菌种  28
      1．3 试剂  28
      1．4 溶液配制  28-29
        1．4．1 DEPC-H_2O  28
        1．4．2 100mg/mL氨苄霉素  28
        1．4．3 LB培养液(基)  28-29
        1．4．4 SOB培养基  29
        1．4．5 SOC培养基  29
    2 方法  29-35
      2．1 野毒株原代毒核酸RNA的提取  29-30
      2．2 VP2高变区的扩增  30-31
        2．2．1 引物的设计与合成  30
        2．2．2 RT-PCR  30
        2．2．3 Nested-PCR  30-31
        2．2．4 PCR扩增鉴定  31
      2．3 PCR产物的回收  31
      2．4 VP2高变区的克隆与鉴定  31-33
        2．4．1 PCR产物与pMD18-T vector的连接  32
        2．4．2 感受态细胞的制备——氯化钙法  32-33
        2．4．3 连接产物的转化  33
      2．5 重组质粒的提取与鉴定  33-35
        2．5．1 SDS碱裂解法小量提取质粒  33-35
        2．5．2 重组质粒的琼脂糖凝胶电泳鉴定  35
        2．5．3 重组质粒的双酶切鉴定  35
      2．6 阳性质粒测序与序列分析  35
    3 结果  35-41
      3．1 RT-PCR结果  35-36
      3．2 目的基因的克隆和测序  36-41
        3．2．1 重组质粒的酶切鉴定  36-37
        3．2．2 序列分析  37-41
    4 讨论  41-42
  试验三 IBDV SD0306在SPF鸡胚上的传代致弱  42-51
    1 材料和方法  42-43
      1．1 病毒  42
      1．2 SPF鸡胚和SPF鸡  42
      1．3 克隆与测序试剂及受体菌  42
      1．4 IBDV SD0306在SPF在鸡胚上的传代  42
      1．5 E11及E15 EID_(50)的测定  42-43
      1．6 鸡胚毒回归SPF鸡试验  43
      1．7 鸡胚毒VP2高变区的克隆与序列分析  43
    2 结果  43-49
      2．1 IBDV SD0306在SPF鸡胚上的增殖  43
      2．2 E11、E15鸡胚的EID_(50)  43
      2．3 动物回归试验  43-44
      2．4 IBDV SD0306鸡胚毒VP2基因高变区的序列分析结果  44-49
    3 讨论  49-51
  试验四 IBDV鸡胚毒免疫效果的研究  51-57
    1 材料与方法  51-52
      1．1 实验材料  51
      1．2 实验分组  51
      1．3 母源抗体水平和免疫后抗体效价的检测  51
      1．4 计算免疫器官指数及观察病理组织切片  51-52
      1．5 人工感染用毒株及攻毒途径  52
      1．6 统计学分析  52
    2 结果  52-55
      2．1 母源抗体水平与免疫后的IBDV抗体效价  52-53
      2．2 疫苗免疫后对免疫器官的影响  53-54
        2．2．1 囊重比与囊指数  53-54
        2．2．2 免疫器官的组织损伤  54
      2．3 NDV抗体水平的检测结果  54
      2．4 E15对攻毒的免疫保护作用  54-55
    3 讨论  55-57
六、结论  57-58
七、参考文献  58-69
八、致谢  69-70
九、攻读学位期间发表论文情况  70-71
十、附图  71-75

传染性法氏囊病病毒山东株的分离鉴定及其鸡胚毒的免疫效果

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