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基因重组蛛丝蛋白作为组织工程支架材料的研究

作　者: 涂桂云
导　师: 李敏
学　校: 福建师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 蛛丝蛋白 高密度发酵 纯化 支架 降解
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
下　载: 98次
引　用: 2次
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内容摘要


蜘蛛丝是一种特殊的纤维蛋白,它具有很高的强度、弹性、柔韧性、伸长度和抗张强度,以及轻盈、耐紫外线、生物可降解等优点,是新一代的天然高分子纤维生物材料,其中尤其以蜘蛛拖丝的力学性能最好。本实验室研究人员利用基因工程方法,合成含有细胞粘附位点RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）的重组蜘蛛拖丝蛋白基因,构建了工程菌pNSR-16/BL21（DE3）pLysS。本论文建立了工程菌pNSR-16/BL21（DE3）pLysS的高密度发酵工艺和重组蛛丝蛋白规模化纯化方法,以此为基础原料,制备组织工程用生物材料丝蛋白纤维薄膜和多孔支架,对所制备的材料进行了体外降解、细胞毒性实验。 在工程菌pNSR-16/BL21（DE3）pLysS摇瓶优化培养的基础上,进行10L发酵罐高密度发酵。采用Do-stat补料分批发酵,最终菌体密度OD600可在60-90范围,产物表达量约占总蛋白量的11～12%。 通过His·Bind亲和层析小量纯化重组蛛丝蛋白,经等电聚焦电泳测定等电点为6.45,蛋白质印迹分析证明表达蛋白为重组蛛丝目的蛋白。超声破碎细胞,调节pH至9.1,60℃加热8～10mins,15%饱和度硫酸铵沉淀等步骤,可以得到纯度达90%以上的制备性重组蛛丝蛋白。 本研究首次报道了利用重组蛛丝蛋白制备生物支架材料及其部分力学性能的测定。纯化的重组蛛丝蛋白经透析、冷冻干燥后,以98%甲酸为溶剂,制备丝蛋白溶液。将丝蛋白溶液平铺于塑料板上可制备薄膜:加NaCl晶体为致孔剂,通过盐沥滤法可制得多孔支架材料。为改善支架材料的力学性能,将丝纤维蛋白与聚合物共混改性,探讨了变性剂、致孔剂及其比例、干燥方法等对共混支架的结构与性能的影响。 选用弹性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶,探讨重组蛛丝蛋白支架材料的体外降解行为,证实了重组蛛丝蛋白支架材料具有生物可降解性。 初步进行了重组蛛丝蛋白支架材料体外细胞毒性实验。

全文目录


内容提要  8-9
Abstract  9-11
序言  11-28
  1. 蜘蛛丝的研究进展  11-16
    1.1 蜘蛛丝的组成与结构特点  11-12
    1.2 蜘蛛丝的特性  12-14
    1.3 利用现代基因工程技术获取蜘蛛丝  14-15
    1.4 蜘蛛丝的应用前景  15-16
  2. 基因工程菌高密度发酵工艺研究进展  16-21
    2.1 重组大肠杆菌构建的几个影响因素  17
    2.2 培养条件  17-20
    2.3 生长抑制因子  20-21
  3. 组织工程生物支架材料  21-26
    3.1 生物支架材料的基本要求  21-22
    3.2 生物支架材料的类型  22-24
    3.3 生物支架材料制备技术  24-25
    3.4 组织工程用支架材料的发展方向  25-26
  4. 本研究的路线与意义  26-28
    4.1 本研究的路线  26
    4.2 本研究的意义  26-28
第一节 工程菌pNSR-16/BL21(DE3)pLysS摇瓶培养及高密度发酵  28-37
  1. 材料  28-29
    1.1 菌株  28
    1.2 主要试剂  28
    1.3 主要仪器  28
    1.4 培养基及主要溶液  28-29
  2. 方法  29-30
    2.1 单菌落制备  29
    2.2 工程菌的摇瓶培养  29
    2.3 工程菌的10L高密度发酵  29
    2.4 分析方法  29-30
  3. 结果  30-35
    3.1 诱导剂IPTG浓度对表达量的影响  30
    3.2 诱导时间对表达量的影响  30-31
    3.3 诱导前菌体浓度对表达量的影响  31-32
    3.4 甘氨酸(Gly)和丙氨酸(Ala)对产物表达的影响  32
    3.5 温度对产物表达的影响  32-33
    3.6 pH值对产物表达的影响  33
    3.7 工程菌PNSR-16分批补料高密度发酵  33-35
  4. 讨论  35-37
第二节 RGD-蜘蛛拖丝重组蛋白的鉴定与分离纯化  37-43
  1. 材料  37-38
    1.1 主要试剂  37
    1.2 主要仪器  37
    1.3 常用溶液  37-38
  2. 方法  38-39
    2.1 细胞超声破碎  38
    2.2 His-Bind亲和层析  38
    2.3 蛋白质印迹分析  38
    2.4 等电聚焦电泳  38-39
    2.5 重组蛛丝蛋白的规模纯化  39
  3. 结果  39-42
    3.1 His-Bind亲和层析  39-41
    3.2 蛋白质印迹分析  41
    3.3 等电点测定  41
    3.4 重组蛛丝蛋白的规模纯化  41-42
  4. 讨论  42-43
第三节 丝蛋白纤维支架材料的制备  43-60
  1. 材料  43
    1.1 主要试剂  43
    1.2 主要仪器  43
  2. 方法  43-45
    2.1 重组蛛丝蛋白粉在不同溶剂中的溶解性  43
    2.2 蛋白溶液制备  43
    2.3 凝固浴的选择  43
    2.4 模具的选择  43
    2.5 丝纤维蛋白薄膜的制备  43-44
    2.6 多孔丝纤维支架材料制备工艺的研究  44-45
    2.7 分析方法  45
  3. 结果  45-56
    3.1 重组蛛丝蛋白粉在不同溶剂中的溶解性  46
    3.2 凝固浴的选择  46
    3.3 模具的选择  46-47
    3.4 丝纤维蛋白薄膜的制备  47-49
    3.5 多孔丝纤维支架材料制备工艺的研究  49-56
  4. 讨论  56-60
    4.1 重组蛛丝蛋白粉的溶解性及凝固浴、模具选择  56
    4.2 凝固浴的选择  56-57
    4.3 模具的选择  57
    4.4 丝纤维蛋白薄膜的制备  57
    4.5 多孔丝纤维支架材料制备工艺的研究  57-60
第四节 重组蛛丝蛋白支架材料的生物降解行为  60-65
  1. 材料  60
    1.1 主要试剂  60
    1.2 主要溶液  60
    1.3 主要仪器  60
  2. 方法  60-61
    2.1 体外水解  60
    2.2 体外酶解  60
    2.3 分析方法  60-61
  3. 结果  61-64
    3.1 体外水解  61
    3.2 体外酶解  61-64
  4. 讨论  64-65
第五节 重组蛛丝蛋白支架材料的细胞毒性试验  65-70
  1. 材料  65
    1.1 主要试剂  65
    1.2 主要溶液  65
    1.3 主要仪器  65
  2. 方法  65-67
    2.1 成纤维细胞原代制备  65
    2.2 MTT实验  65-66
    2.3 重组蛛丝蛋白支架材料--成纤维细胞的复合培养  66
    2.4 重组蛛丝蛋白支架材料浸提液的pH与离子强度测定  66-67
    2.5 分析方法  67
  3. 结果  67-68
    3.1 支架材料的浸提液培养成纤维细胞  67
    3.2 支架材料复合成纤维细胞  67-68
    3.3 支架材料浸提液的pH与离子强度测定  68
  4. 讨论  68-70
结论  70-71
参考文献  71-78
附图  78-80
英文缩略词表  80-81
在学期间发表论文及专利申请情况  81-82
致谢  82-83
摘要  83-84

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医用一般科学 > 生物医学工程 > 一般性问题 > 生物材料学
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