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重组人干扰素α长效注射微球的研究

作　者: 吴诚
导　师: 钟延强
学　校: 第二军医大学
专　业: 药剂学
关键词: 干扰素α 微球聚乳酸-羟基乙酸嵌段共聚物(PLGA) 复乳法固体/油/油法 BCA 含量测定法长效制剂
分类号: R94
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

干扰素α(Interferon-α,IFN-α)具有广泛的抗病毒、抗增殖和调节免疫机能等生物学活性。在临床上广泛用于治疗各种病毒性疾病和多种恶性肿瘤,其中对慢性乙肝、丙肝、巨细胞病毒感染、血源性恶性肿瘤疗效确切。常规给药方式为肌注或皮下注射,但其生物半衰期短(5-7h),常需频繁注射给药,给病人用药带来很大的不便。本课题设计采用体内可生物降解的高分子材料聚乳酸羟基乙酸嵌段共聚物(PLGA)将 IFN-α包被成微球,通过微球内部的孔道以及高分子材料的融蚀降解来调控 IFN-α在体内外的释放, 以期达到一次给药后 4 周持续释放药物的长效缓释效果,从而提高用药质量和病人用药的顺应性。课题工作首先研究了复乳法(w/o/w)制备 IFN-αPLGA 微球的制备工艺及其影响因素。通过单因素实验设计考察了制备复乳时的搅拌速度、外水相聚乙烯醇(PVA)浓度、油相 PLGA 浓度、内水相渗透压以及 PLGA 的平均分子量等因素对微球形态、平均粒径和包封率的影响。结果表明制备复乳时的搅拌速度、PVA 浓度、PLGA 浓度、内水相渗透压和缓冲系统都对微球的外观和粒径有显著影响。微球形态和粒径是微球释药调控的重要因素,微球粒径越小,突释效应越明显。IFN-α的包封率通常较高(80%以上),在试验条件下除 PLGA 浓度、PVA 浓度对包封率影响较大以外,各因素对于包封率的影响不显著。试验中还发现内水相的渗透压可以显著的影响微球的粒径、外观以及释药特性。内水相脱盐后,可使制备的微球粒径和数目减小,密度增大,突释效应显著降低。文献报道复乳法制备微球的影响因素较多,且由于制备过程中形成了油水界面,易导致蛋白质失活。因而本试验进一步研究了固体/油/油法(s/o/o)制备IFN-αPLGA 微球的处方及制备工艺。试验中首先制备了 Zn2+与 IFN-α复合物,并证明了 Zn2+与 IFN-α复合物是一种可溶性沉淀,溶解后在电泳和凝胶色谱上的行为与 IFN-α原液一致。根据文献报道采用相凝聚法成功地制备了 IFN-α及其Zn2+复合物的微粉,并将其包被成微球。通过单因素实验考察了 PLGA 浓度、搅拌速度、IFN 微粉粒径、油相中的添加剂等因素对微球粒径、外观以及包封率的影响。试验中发现 PLGA 浓度、搅拌速度以及甘露醇等添加剂对微球粒径和外观影响显著。由于蛋白质在外油相中不溶解,因而包封率通常较高(90%以上)。IFN-α经 Zn2+处理形成复合物、油相中加入甘露醇、伯洛沙姆 188(F-68)等添加剂则可显著地改变微球的释药特性,尤其对突释效应影响显著。以 BCA(Bicinchoninic acid,二喹啉甲酸)分析法测定了释放介质中 IFN-α的浓度,考察了微球的体外释放特性。体外释放试验表明微球具有显著的长效作用,可以缓慢释放药物 30 天左右。用平均分子量为 34,000 的 PLGA 制备的 1<WP=6>中英文摘要微球,与文献报道一致,微球的体外释放曲线可以分为三相:速释相、时滞相和缓释相。但时滞相较长,缓释相累积释放较少,微球的处方和制备工艺对于微球的速释相影响显著,对于时滞相和缓释相影响较小。而用 PLGA 平均分子量为14,000的PLGA制备的微球时滞相则不明显,缓释相的累积释放达到了50%左右,说明 PLGA 的平均分子量是微球体外释放时滞相和缓释相的主要影响因素。处方工艺优化后用复乳法和固体/油/油法(s/o/o)制备的 PLGA 微球突释效应控制在了 10%左右,累积释放在 60%左右,体外释药均符合零级释放方程。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、分子排阻色谱以及细胞病变抑制法(CPE)等方法考察了制备工艺和释放过程中 IFN-α的稳定性。试验表明 IFN-α溶液在 37℃条件下放置一个月可形成少量聚集产物和降解产物。复乳法制备工艺对 IFN-α的稳定性影响较小,微球中的 IFN-α比活性较高,但在微球的体外释放过程中 IFN-α的比活性明显下降。用 s/o/o 法制备的 IFN-α和 Zn2+复合物微球中的 IFN-α比活性较低,SDS-PAGE 试验也表明微球中的复合物用 EDTA 溶解后仍有少量二聚体产生,可能与 IFN 和 Zn2+复合物本身溶解性较差和制备微粉的冷冻干燥过程中未加保护剂有关。结论:采用可生物降解的聚合物 PLGA 作为载体材料,可以将 IFN-α制备成缓释一个月的微球注射剂,该制剂应用前景广阔。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-10
前言  10-13
第一部分干扰素α长效注射微球中药物含量和生物学活性测定方法的建立  13-22
  一仪器与材料  13
  二方法与结果  13-19
  三讨论  19-22
第二部分复乳法制备干扰素α长效注射微球  22-36
  一仪器与材料  22
  二方法与结果  22-33
    (一) 一般制备工艺  22-23
    (二) 微球形态  23-24
    (三) 复乳法制备干扰素α长效注射微球的单因素考察  24-32
    (四) 处方的优选  32-33
  三小结与讨论  33-36
第三部分无水法制备干扰素α长效注射微球  36-48
  一仪器与材料  36
  二方法与结果  36-45
    (一) 一般制备工艺  36-37
    (二) 微球形态  37-39
    (三) s/o/o 法制备 IFN-α微球处方工艺的筛选  39-43
    (四) 处方的优选  43-45
    (五) 两种制备工艺的比较  45
  三小结与讨论  45-48
第四部分干扰素α在制备工艺和体外释放过程中的稳定性研究  48-64
  一仪器与材料  48
  二方法与结果  48-60
    (一) 微球中 IFN-α样品的制备  49
    (二) 分子排阻色谱法测定 IFN-α的纯度  49-55
    (三) SDS-聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)测定 IFN-α的纯度  55-58
    (四) IFN-α生物学活性的测定  58-60
  三小结与讨论  60-64
致谢  64-65
综述蛋白质药物 PLGA 微球处方工艺设计中的稳定化策略  65-73

重组人干扰素α长效注射微球的研究

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