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玻璃化冻存对小鼠骨髓有核细胞生物学特性的影响

作　者: 周国英
导　师: 胡军祥
学　校: 浙江大学
专　业: 生理学
关键词: 玻璃化冻存骨髓有核细胞回收率存活率琥珀酸脱氢酶 (SDH)活性 H2O2含量超氧化物歧化酶(SOD)活性细胞培养诱导骨髓间质干细胞神经细胞软骨细胞
分类号: Q952
类　型: 硕士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

本文以成年ICR小鼠为实验材料，用玻璃化方法对骨髓有核细胞进行液氮（-196℃）冻存。通过两部分的研究以探索文中所采用的玻璃化冻存技术对骨髓有核细胞的影响，一方面通过检测冻存后细胞的回收率、存活率、线粒体内琥珀酸脱氢酶（SDH）的活性、细胞中过氧化氢（H₂O₂）含量和细胞中超氧化物歧化酶（SOD）活性以观察玻璃化冻存对骨髓有核细胞存活率和多种酶活性的影响；另一方面通过体外培养玻璃化冻存后的骨髓有核细胞，检测其贴壁率和细胞生长曲线，通过传代纯化、扩增骨髓间质干细胞，从形态学角度观察冻存后骨髓间质干细胞生物学功能的变化。（1）玻璃化冻存程序：用两步预平衡法对骨髓有核细胞进行玻璃化冻存，在室温（20℃）下将骨髓有核细胞放入50％浓度的玻璃化溶液中，平衡5min，然后把细胞移入4℃水浴中，继续加入玻璃化溶液，使其终浓度达到90％，继续平衡5min后，把细胞悬液分装入塑料冻存管中，直接投入液氮（-196℃）保存。在冻存1～30d后，取出细胞样品，立即投入38℃水浴中快速复温，然后用分步法洗脱冻存液。先用1.5M蔗糖溶液洗脱，离心后弃上清液，再用0.5M蔗糖洗脱，最后用新鲜D-Hanks液洗脱三次。（2）筛选达到稳定的最短冻存天数：玻璃化冻存液成份为：DMSO-18.5％（W／V），乙酰胺-14.0％（W／V），丙二醇-9.0％（WN），聚乙二醇（MW6000）-4.1％（W／V）。从骨髓有核细胞的回收率、存活率和SDH活性、H₂O₂含量、SOD活性的变化看，玻璃化冻存20d后，细胞的各项指标基本达到一个稳定状态。用该冻存液冻存的骨髓有核细胞在第20d时，回收率为86.57±1.33，存活率为85.88±1.98，SDH活性为0.598±0.011，H₂O₂含量为0.327±0.010,SOD活性为61.36±1.53。这些结果表明文中所选用的玻璃化冻存方法对细胞酶活性影响不大，存活率较高。（3）冻存后的骨髓有核细胞培养：对玻璃化冻存后的骨髓有核细胞以1×10⁶个／ml密度进行体外培养，观察到骨髓有核细胞贴壁情况良好，贴壁时间稍晚，培养后细胞仍然能够正常生长、增殖，其中的骨髓MSCs仍然保持其特有的诱导浙江大学硕士学位论文分化功能。传至第3代的细胞用含125 pl黄蔑注射液/ml的神经细胞预诱导液作为神经细胞的诱导液，预诱导48h+诱导48h后，相差显微镜下可见到神经细胞样细胞;用含10n留mlTGF一日1、10.7mo呱地塞米松、10u/m1胰岛素、ZOmmo比p一甘油磷酸钠、10（）U/ml青霉素和100协岁ml链霉素的无血清DMEM一HG培养液作为软骨细胞的诱导液诱导14d后，相差显微镜下可观察到成纤维细胞基本上诱导为软骨细胞样细胞。这些结果表明文中所选用的玻璃化方法对骨髓间质干细胞生物学特性的影响甚少。虽然骨髓有核细胞在玻璃化冻存过程中，由于保护剂的毒性、降温一复温过程和冻存液的洗脱等因素会对细胞的结构与功能造成一定的影响，但仍能保持细胞较高的活性，表明该技术对骨髓有核细胞的长期低温保存具有一定的实际应用意义，并为大体积组织器官的长期冷冻保存理论和实验依据。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-9
一、前言  9-15
二、材料与方法  15-22
  Ⅰ 骨髓有核细胞的玻璃化冻存  15-19
    (一) 实验材料  15
    (二) 实验方法  15-17
      1 骨髓有核细胞悬液的制备  15-16
      2 实验分组  16
      3 骨髓有核细胞的玻璃化冻存  16-17
    (三) 玻璃化冻存对骨髓有核细胞的影响  17-19
      1 骨髓有核细胞的回收率和存活率测定  17
      2 MTT法测定骨髓有核细胞中琥珀酸脱氢酶(SDH)的活性  17
      3 骨髓有核细胞中过氧化氢(H_2O_2)含量的测定  17
      4 骨髓有核细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性的测定  17-18
      5 统计学处理  18-19
  Ⅱ 骨髓有核细胞的体外培养  19-22
    (一) 实验材料  19-20
    (二) 实验方法  20-22
      1 实验分组  20
      2 培养新鲜和冻存后的骨髓有核细胞  20-21
        2.1 骨髓有核细胞的形态学观察  20
        2.2 骨髓有核细胞贴壁率的测定  20-21
        2.3 骨髓有核细胞的生长曲线测定  21
        2.4 骨髓间质干细胞诱导分化为神经细胞  21
        2.5 骨髓间质干细胞分化为软骨细胞  21
      3 统计学处理  21-22
三、结果  22-33
  Ⅰ 骨髓有核细胞的玻璃化冻存  22-26
    1 玻璃化冻存的骨髓有核细胞的回收率和存活率  22-23
    2 MTT活性检测  23-24
    3 H_2O_2的含量测定  24-25
    4 SOD的活性检测  25-26
  Ⅱ 骨髓有核细胞的体外培养  26-33
    1 骨髓有核细胞的分离、扩增情况比较  26-28
    2 骨髓有核细胞的贴壁率比较  28
    3 骨髓有核细胞的生长曲线比较  28-29
    4 骨髓间质干细胞诱导分化为神经细胞的比较  29-31
    5 骨髓间质干细胞诱导分化为软骨细胞的比较  31-33
四、讨论  33-41
  1 玻璃化冻存对细胞膜的影响  33-35
  2 玻璃化冻存对酶活性的影响  35-36
  3 玻璃化冻存对骨髓有核细胞贴壁率和扩增的影响  36-38
  4 玻璃化冻存对骨髓间质干细胞诱导功能的影响  38-41
    4.1 骨髓间质干细胞诱导为神经细胞  38-39
    4.2 骨髓间质干细胞诱导为软骨细胞  39-41
五、小结  41-42
六、参考文献  42-47
文献综述  47-55
致谢  55

玻璃化冻存对小鼠骨髓有核细胞生物学特性的影响

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