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应用原生质体技术筛选高产耐碱性的脂肪酶菌株的试验

作　者: 单志文
导　师: 周晓云
学　校: 浙江工业大学
专　业: 生物工程
关键词: 遗传标记 原生质体 融合子 酶活 生长特性
分类号: Q93-331
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
下　载: 136次
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内容摘要


本文首先对酵母进行遗传标记，然后对影响酵母菌和链霉菌原生质体制备的因素、影响酵母菌和链霉菌原生质体远缘融合的因素进行研究，在获得融合子的条件下，进行生长曲线的测定，形态的观察，酶活力的测定。 在酵母遗传标记的实验中，我们通过诱变获得一株赖氨酸缺陷型的菌株。实验方法是使用制霉菌素浓缩法来富集营养缺陷菌。最佳诱变条件：DES浓度为3％，作用时间90min或DES浓度为3％+紫外线照射2分钟，DES作用时间60min两种组合来进行诱变。制霉菌素富集的最佳条件：制霉菌素浓度为100u/ml，作用时间为60min。 在酵母菌和链霉菌原生质体制备过程中，酵母破壁时的稳定剂选山梨醇（0.8mol/L），做再生时选蔗糖（0.5mol/L，也即17％）；酶选择1％蜗牛酶+1％纤维素酶，再加适量溶菌酶，作用时间210-24O分钟；预处理剂选0.1mol/L E D TA溶液配制成0.1％疏基乙醇，作用时间30分钟。链霉菌稳定剂用蔗糖，酶用溶菌酶破壁，浓度2％，作用时间10-15分钟，预处理剂不加。 在两亲株融合的过程中，影响酵母菌和链霉菌融合率的因素大小顺序如下：CaCl2。浓度＞PEG作用时间＞PEG的浓度，钙离子的浓度明显影响酵母菌和链霉菌的融合率。最佳融合条件：PEG的浓度35％、CaCl2。浓度50mmol/L、PEG作用时间30min、稳定剂蔗糖浓度0.5、pH值7.0。 在融合子的鉴定过程中，挑选出来的融合子菌落形态并未见菌丝，外观类似酵母，菌落及细胞的尺寸都大于亲株酵母。融合子的对数生长期在32-36小时出现，处于酵母的24小时和链霉菌的48小时之间。测定融合子YS1、YS8酶活力，酶活最高峰出现在ph8.6，分别为789u/ml、836.7u/ml，比亲株酵母耐碱性，但酶活力不如；YS6酶活最高峰出现在pH10，酶活194.5u/ml。比亲株链霉菌酶活力高。

全文目录


中文摘要  4-5
英文摘要  5-7
第一章 文章综述  7-24
  1．1 本课题的研究意义和目的  7-8
  1．2 本课题的研究内容  8
  1．3 碱性脂肪酶的应用  8-11
  1．4 细胞融合及其发展  11-17
    1．4．1 发展史  11-12
    1．4．2 原生质体融合亲本的选择标记  12-14
    1．4．3 细胞融合机理  14-15
    1．4．4 酵母和缘远菌种融合的基因重组理论探讨  15-17
  1．5 原生质体融合技术的进展  17-20
    1．5．1 非特异性细胞电融合技术  17-19
    1．5．2 特异性电融合技术  19-20
    1．5．3 激光诱导的细胞融合技术  20
  1．6 融合子基因产物表达  20-22
  1．7 本章小节  22-24
第二章 酵母的遗传标记  24-33
  2．1 材料和方法  24-28
  2．2 结果和讨论  28-31
    2．2．1 DES诱变的致死率  28
    2．2．2 营养缺陷性菌株的鉴定  28-31
  2．3 本章小节  31-33
第三章 原生质体的制备  33-49
  3．1 材料和方法  34-38
  3．2 结果与讨论  38-47
    3．2．1 稳定剂对酵母原生质体产量和质量的影响  38-40
    3．2．2 预处理剂对酵母原生质体产量和质量的影响  40
    3．2．3 酶溶液对酵母原生质体产量和质量的影响  40-41
    3．2．4 不同时间酶溶液对酵母原生质体的影响  41-42
    3．2．5 综合因素  42-44
    3．2．6 甘氨酸对链霉菌原生质体制备的影响  44-46
    3．2．7 稳定剂对链霉菌原生质体制备的影响  46-47
    3．2．8 溶菌酶不同浓度对链霉菌原生质体制备的影响  47
  3．3 本章小节  47-49
第四章 融合重组及重组子的检出  49-62
  4．1 材料与方法  49-55
  4．2 结果与讨论  55-61
    4．2．1 融合子的检出  55
    4．2．2 高渗溶液及不同pH对融合率的影响  55-56
    4．2．3 酵母与链霉菌的融合正交实验  56-58
    4．2．4 融合子的形态和生理特性  58-59
    4．2．5 酶活力的测定  59-61
  4．3 本章小节  61-62
第五章 问题与建议  62-63
参考文献  63-66
致谢  66

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学 > 微生物研究与微生物实验 > 微生物学技术与微生物学实验 > 微生物鉴定
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