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正常人表皮黑素细胞体外培养系的建立及熊果苷对黑素细胞的作用效应

作　者: 丁国斌
导　师: 陈璧
学　校: 第四军医大学
专　业: 外科学（烧伤）
关键词: 碱性成纤维细胞生长因子霍乱毒素黑素细胞酪氨酸酶黑素合成熊果苷曲酸维生素C磷酸酯
分类号: R329.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
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内容摘要

浅二度烧伤愈合后局部皮肤常出现色素沉着异常，表现为色素沉着不足或色素过度沉着，且多发生在面部、手部等暴露部位，对患者的外观影响较大。由于对其发生机理还了解不多，因而尚无理想的治疗方法。体外培养的黑素细胞（MC）移植是近来治疗烧伤后色素沉着不足的一种较好方法，但由于正常人表皮MC数量少，增殖力弱，体外培养常因角朊细胞（KC）或成纤维细胞（Fb）的过度生长而失败，而传统MC培养方法是利用培养液中的添加剂对KC和Fb的抑制作用，如十四烷酰佛波醇乙酯（TPA）抑制KC的生长，基因素（geneticin）抑制Fb的生长，由于这些物质具有较多副作用，尤其TPA是一种强致癌剂，用TPA培养的MC移植治疗烧伤后色素沉着不足时有一定的致癌风险。随着对MC旁分泌调节的研究进展，人们发现碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等生长因子可刺激MC的增殖，由于bFGF是天然生长因子，以bFGF为主要丝裂原培养的MC移植治疗烧伤后色素沉着不足，应比传统培养方法更安全。目前有关烧伤后色素过度沉着的治疗的研究报道较少，治疗方法不多且效果欠佳。熊果苷对色素增多性皮肤病如黄褐斑、老年斑等有较好疗效，未发现有副作用，但尚未见有用于治疗烧伤后色素过度沉着的报道。同时，由于所使用的黑素细胞系及培养方法的不同，有关熊果苷的作用效果和机理的实验结果差异很大。以bFGF为主要丝裂原进行MC培养，培养环境将更接近MC的体内环境，以利用此方法培养的MC作为模型研究熊果苷的脱色素作用，实验结果对临床应用将更具参考价值。第四军医大学硕士学位论文本实验利用 bFGF和霍乱毒素（CT）协同配对，建立正常人表皮 MC的体外选择性纯培养，观察所培养MC的形态和增殖力等生物学特性，摸索传代、冻存及复苏等操作的最佳条件，并初步尝试自体移植利用此系统培养的MC膜片治疗烧伤后色素沉着不足。然后利用这一系统测定熊果昔的脱色素作用，MTT法测定对MC增殖力的影响，以LDoPa为底物测定酪氨酸酶活性，比色法测定黑素合成量，并与临床常用脱色素药物维生素 C磷酸酯（AP）及曲酸的结果相比较，进而初步观察了 5％熊果苦膏剂对烧伤后色素过度沉着的临床防治效果。实验结果如下：1．利用bFGF／CT成功建立了正常人表皮黑素细胞的体外选择性纯培养，可避免 KC和 Fb的污染，培养成功率约 70％；原代接种密度以 2x10’儿m‘为宜，传代培养时接种密度以 lxl OVcm’为宜；黑素细胞可传代 7～8代，约7周后细胞者化失去增殖能力，细胞可倍增＊次左右，平均群体倍增时间约为一．5天；细胞可耐受液氮冻存，复苏后接种存活率约 60 ％。2．熊果音浓度为 lwt时抑制黑素细胞活力约 7％，在＜0．ling／ml时对黑素细胞无毒性，此时对酪氯酸酶呈浓度依赖性抑制，半数抑制剂量门＊约为ling／m！，在叼刀01m g／mg／ml时对酪氨酸酶无抑制作用，浓度0刀ling／ml的熊果昔可使黑素合成抑制 14％。3．曲酸在 ling／ffil和 0．ling／Inl时的细胞活力抑制率分别为 37％和 23％，在 0刀 lmgithlo刀00！m咖l时对细胞活力无影响，AP各浓度对细胞活力均无影响。曲酸在 ling／ttil和 0．ling／nil时酪氨酸酶抑制率分别为 49％和16％，在无细胞毒性的浓度下对酪氢酸酶无抑制，AP仅在 ling／ml时对酪氨酸酶有抑制作用。0刀 ling／ml的曲酸对黑素合成无抑制作用，而0刀 ling／ffil的 AP可抑制 6％。4．培养的 MC细胞膜片自体移植治疗 1例手部烧伤后色素沉着不足，5％ 4 第四军医大学硕士学位论文熊果昔青剂治疗3例面部烧伤后色素过度沉着，早期效果较好。实验结果表明，利用bFGF／CT建立正常人表皮黑素细胞的体外选择性纯培养，具有安全，成功率高，培养条件更接近体内黑素细胞环境的优点，利用此系统培养的黑素细胞自体移植治疗烧伤后色素沉着不足是可行的。熊果昔的细胞毒性低，对酪氨酸酶及黑素合成有较强的抑制作用，5％熊果苦膏剂可作为防治烧伤后色素过度沉着的理想药物。

全文目录

英文缩略词表  3-5
中文摘要  5-8
英文摘要  8-11
前言  11-15
第一部分正常人表皮黑素细胞培养系的建立  15-26
  主要试剂和仪器  15-16
  实验方法  16-18
  结果  18-21
  讨论  21-24
  参考文献  24-26
第二部分熊果苷对正常人表皮黑素细胞的作用效应  26-35
  主要试剂和仪器  26-27
  实验方法  27-29
  结果  29-31
  讨论  31-34
  参考文献  34-35
结论  35-36
文献回顾  36-69
  皮肤黑素细胞的生物学特性  36-38
  黑素细胞体外培养方法的研究进展  38-47
  黑素合成机理及调控的研究进展  47-59
  参考文献  59-69
致谢  69-70
附图  70-83

正常人表皮黑素细胞体外培养系的建立及熊果苷对黑素细胞的作用效应

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