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滨海白首乌影响黑素合成功效组分的筛选

作　者: 姚文杰
导　师: 王晓岚
学　校: 江南大学
专　业: 食品科学
关键词: 白首乌黑素合成酪氨酸酶抑制作用激活作用
分类号: R284
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

滨海白首乌属藦萝科植物耳叶牛皮消（Cynanchum auriculatum Royle ex Wight）。白首乌是我国的传统中药,具有乌须黑发、抗氧化、增强免疫功能等功效。本文通过对滨海白首乌主要成分C₂₁甾苷进行筛选,得到对黑素合成有影响作用的活性组分,该组分作为一种植物提取的天然活性物质,具有更高的经济价值。并对其抑制、激活机理进行探讨,也为白首乌功能性产品的开发提供实验依据。本文将白首乌的主要成分C₂₁甾苷进行柱层析分离,收集洗脱部分。通过多巴速率氧化法初筛体系、豚鼠皮肤黑素合成模型,从体外化学反应水平到体内整体水平两个层次,对白首乌中抑制、激活黑素合成的活性成分进行筛选及药效学研究。主要研究结果如下:采用加热回流提取法,对白首乌进行乙醇提取,并通过化学萃取得到总甾苷。对总甾苷进行定性、定量实验,检测的结果是总甾苷中C₂₁甾苷的含量为85.22%。并通过多巴速率氧化法初筛体系,检测总甾苷对酪氨酸酶活性的影响,发现其对酪氨酸酶有激活作用。对白首乌C₂₁甾苷进行了硅胶柱层析分离,筛选出对酪氨酸酶活性有影响的组分C₂₁甾苷（Ⅱ）、（Ⅲ）、（Ⅴ）,其中C₂₁甾苷（Ⅲ）对酪氨酸酶有抑制作用,而C₂₁甾苷（Ⅱ）、（Ⅴ）对酪氨酸酶有激活作用。白首乌C₂₁甾苷（Ⅲ）对酪氨酸酶抑制机理研究结果表明:C₂₁甾苷（Ⅲ）对酪氨酸酶抑制作用显著,可使酶促反应进程出现较长迟滞期,稳态酶活力缓慢下降。其终浓度0.08mg/mL时,迟滞时间为294s,稳态酶活力下降67.79%。C₂₁甾苷（Ⅲ）对酪氨酸酶的抑制机理为竞争性抑制。C₂₁甾苷（Ⅱ）对酪氨酸酶的激活作用约是总甾苷的4.01倍;由C₂₁甾苷（Ⅱ）对酪氨酸酶活性影响的特性曲线说明,它对酪氨酸酶具有竞争性和非竞争性双重性激活作用。豚鼠实验结果也显示:抑制黑素合成活性组分即C₂₁甾苷（Ⅲ）作用后,黑素颗粒含量显著低于对照组。这说明C₂₁甾苷（Ⅲ）不仅在体外直接抑制蘑菇酪氨酸酶活性而且还可在整体水平抑制豚鼠皮肤黑素合成;促进黑素合成的活性组分即C₂₁甾苷（Ⅱ）、C₂₁甾苷（Ⅴ）作用后,用药组黑素颗粒含量显著高于正常组,同样说明C₂₁甾苷（Ⅱ）、C₂₁甾苷（Ⅴ）不仅在体外直接激活蘑菇酪氨酸酶活性而且还可在整体水平促进豚鼠皮肤黑素合成。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-9
第一章绪论  9-18
  1.1 研究背景  9-14
    1.1.1 黑素、酪氨酸酶与黑素合成  9-10
    1.1.2 黑素合成的影响和调控因素与色素障碍性疾病  10-11
    1.1.3 防治色素沉着性疾病国内外研究进展  11-12
    1.1.4 防治色素脱失性疾病国内外研究进展  12-13
    1.1.5 在食品领域黑素的研究  13-14
  1.2 立题依据  14-16
    1.2.1 白首乌  14
    1.2.2 白首乌的主要活性成分  14
    1.2.3 白首乌的药理学作用及机制  14-16
  1.3 立题意义  16-17
  1.4 课题内容  17-18
第二章白首乌活性组分的初筛  18-27
  2.1 引言  18
  2.2 材料与方法  18-21
    2.2.1 原药材  18-19
    2.2.2 生化试剂和主要仪器  19
    2.2.3 实验试剂的制备  19
    2.2.4 酪氨酸酶活力的检测方法  19-20
      2.2.4.1 酪氨酸酶活力的测定  19-20
      2.2.4.2 脂溶性样品助溶剂的选择  20
    2.2.5 样品的检测方法  20-21
      2.2.5.1 样品的定性检测实验  20
      2.2.5.2 总甾苷的定量实验  20
      2.2.5.3 硅胶柱洗脱物的薄层层析法检测实验  20-21
    2.2.6 白首乌有效成分总甾苷的提取分离  21
      2.2.6.1 白首乌总甾苷的提取  21
      2.2.6.2 白首乌总甾苷的萃取分离  21
    2.2.7 白首乌总甾苷的分离  21
      2.2.7.1 总甾苷粗分  21
      2.2.7.2 总甾苷细分  21
  2.3 结果与讨论  21-25
    2.3.1 酶促反应中助溶剂及其稀释浓度的选择  21-22
    2.3.2 总甾苷的定性实验  22-23
    2.3.3 总甾苷的定量实验  23
    2.3.4 总甾苷对酪氨酸酶活力影响的检测  23
    2.3.5 总甾苷粗分与检测  23-25
      2.3.5.1 硅胶柱洗脱物的薄层层析检测  23-24
      2.3.5.2 硅胶柱洗脱物的酶活力测定  24-25
    2.3.6 二次硅胶柱分离与酶活力检测  25
  2.4 本章小结  25-27
第三章白首乌活性组分对酪氨酸酶活性的影响作用  27-37
  3.1 引言  27-28
  3.2 实验材料与方法  28-30
    3.2.1 实验材料  28
    3.2.2 生化试剂和主要仪器  28
    3.2.3 样品制备  28-29
      3.2.3.1 C_(21) 甾苷组分的制备  28-29
      3.2.3.2 氢醌溶液的制备  29
      3.2.3.3 补骨脂乙醇提取液的制备  29
    3.2.4 实验方法  29-30
      3.2.4.1 酪氨酸酶活性分析方法  29
      3.2.4.2 样品C_(21) 甾苷(Ⅲ)对酪氨酸酶单酚酶活力的影响  29
      3.2.4.3 样品C_(21) 甾苷(Ⅲ)对酪氨酸酶二酚酶抑制作用机理  29-30
      3.2.4.4 样品C_(21) 甾苷(Ⅲ)对酪氨酸酶二酚酶抑制类型  30
      3.2.4.5 样品C_(21) 甾苷(Ⅱ)对酪氨酸酶活性的动力学观察  30
  3.3 结果与分析  30-36
    3.3.1 C_(21) 甾苷(Ⅲ)对酪氨酸酶抑制作用的测定  30-34
      3.3.1.1 分离组分C_(21) 甾苷(Ⅲ)对酪氨酸酶活性的测定  30
      3.3.1.2 C_(21) 甾苷(Ⅲ)对酪氨酸酶单酚酶活力的影响  30-31
      3.3.1.3 C_(21) 甾苷(Ⅲ)对酪氨酸酶二酚酶活性作用的影响  31-33
      3.3.1.4 提取物C_(21) 甾苷(Ⅲ)对酪氨酸酶二酚酶的抑制类型的判断  33-34
    3.3.2 C_(21) 甾苷(Ⅱ)对酪氨酸酶激活作用的测定  34-36
      3.3.2.1 C_(21) 甾苷(Ⅱ)对促进酪氨酸酶活性作用的影响  34-35
      3.3.2.2 C_(21) 甾苷(Ⅱ)提高酪氨酸活性的动力学观察  35-36
  3.4 结论  36-37
第四章白首乌活性组分对豚鼠皮肤黑素合成的影响  37-51
  4.1 引言  37
  4.2 材料与方法  37-39
    4.2.1 动物  37
    4.2.2 原材料  37
    4.2.3 主要试剂与仪器  37-38
    4.2.4 实验药物制备  38
    4.2.5 实验分组  38
      4.2.5.1 黑素抑制实验  38
      4.2.5.2 黑素促进实验  38
    4.2.6 取材  38-39
    4.2.7 实验指标  39
      4.2.7.1 HE 染色  39
      4.2.7.2 Fontana 银氨染色法  39
      4.2.7.3 Schmorl 反应法  39
  4.3 结果与讨论  39-50
    4.3.1 组织病理形态学观察  39-41
    4.3.2 黑素含量的Schmorl 反应法结果分析  41-45
      4.3.2.1 抑制黑素合成药物作用后豚鼠皮肤Schmorl 反应法结果  41-44
      4.3.2.2 促进黑素合成药物作用后豚鼠皮肤Schmorl 反应法结果  44-45
    4.3.3 黑素含量的Fontana 银氨染色法结果分析  45-50
      4.3.3.1 抑制黑素合成药物作用后豚鼠皮肤Fontana 银氨染色法结果  45-48
      4.3.3.2 促进黑素合成药物作用后豚鼠皮肤Fontana 银浸法结果  48-50
  4.4 本章小结  50-51
结论与展望  51-53
  一、本研究的主要结论  51
  二、论文的创新性及应用价值  51-52
  三、存在的问题及展望  52-53
致谢  53-54
参考文献  54-60
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文  60

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