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硫酸镍对小鼠精原细胞Bax和Caspase3 mRNA和蛋白表达的影响

作　者: 丁皎
导　师: 孙应彪
学　校: 兰州大学
专　业: 卫生毒理学
关键词: 硫酸镍精原细胞分离纯化氧化应激基因和蛋白表达
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的建立小鼠精原细胞体外分离纯化和培养的方法,观察硫酸镍对体外培养的小鼠精原细胞氧化应激效应指标及其Bax和Caspase3 mRNA和蛋白表达的影响,探讨镍致小鼠精原细胞损伤的可能机制。方法(1)选择6～8d健康雄性小鼠,无菌条件下摘取双侧睾丸,采用酶消化法(1g／L胶原酶Ⅳ、1.5g／L透明质酸酶和0.25%胰蛋白酶)结合Percoll密度梯度离心法分离纯化小鼠精原细胞,置于二氧化碳培养箱(37℃、5%CO2)贴壁培养后进一步纯化,并采用碱性磷酸酶进行纯度鉴定。(2)取对数生长期细胞,设置对照组和染毒组,即硫酸镍(NiSO4)50、100、200、400、800μmol／L组,染毒后分别培养6、12、24和36小时；在各染毒终点收割细胞,超声处理后离心取上清液,采用酶标仪检测总抗氧化能力(T-AOC)、羟自由基(-OH·)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)水平的变化。(3)取对数生长期细胞,每瓶接种细胞体积10ml(1×107个／ml),设置对照组和染毒组,即硫酸镍200、400μmol／L组,染毒后分别培养12h、24h；染毒结束后,收割各染毒终点细胞分别提取精原细胞总RNA和总蛋白,采用实时荧光定量PCR技术和Western-bilting技术检测小鼠精原细胞Bax和Caspase3 mRNA和蛋白的表达水平。结果(1)分离纯化的小鼠精原细胞培养24h后,倒置显微镜下可见精原细胞呈散在或成串、成链状生长,部分细胞胞膜相连出现细胞间桥,单个精原细胞胞体较大、胞质少,呈圆形,核大而圆,核中央可见1～3个核仁,细胞饱满发亮,折光性强。碱性磷酸酶染色后,大量精原细胞上有棕褐色沉淀物附着。(2)镍可引起精原细胞-OH·含量升高,T-AOC、GSH-Px(?)力降低。相同染毒时间,NiSO4各浓度组与对照组比较：染毒各时间段,NiSO4200、400和800μmol／L组T-AOC、-OH·含量及其GSH-Px活力与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)；染毒36h后NiSO450μmol／L组开始出现-OH·含量升高及T-AOC水平的下降(P<0.05),并呈现明显的剂量-效应关系。相同染毒浓度,各染毒时间组与0h组比较：NiSO450μmol／L染毒36h后开始出现T-AOC含量的降低和-OH·含量的升高(P<0.05)；NiSO4 100μmol／L染毒24h和36h均出现GSH-Px、-OH·和T-AOC的改变(P<0.05)；NiSO4200μmol／L及其以上组,各时间组T-AOC、-OH、GSH-Px与Oh组比较差异均有统计学意义(P<0.05),并呈现一定的时间-效应关系。(3)NiSO4200μmol／L、400μmol／L染毒12h和24h后,各组Bax和Caspase-3 mRNA的表达均上调,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Western-bloting结果显示,硫酸镍各组Bax、Caspase3蛋白表达随着染毒时间和浓度的增加均有表达量上升的趋势。结论酶消化法结合Percoll密度梯度离心法体外分离纯化和培养精原细胞是可行的,能够获得较高纯度的精原细胞。镍导致小鼠精原细胞的损伤可能与其所致氧化应激效应增强以及Bax和Caspase3 mRNA和蛋白表达上调有关。

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中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
前言  9-16
第一部分精原细胞分离纯化及体外培养  16-22
  1 材料与方法  16-18
  2 结果  18-20
  3 讨论  20-22
第二部分氧化应激效应在镍致精原细胞损伤中的作用  22-29
  1 材料与方法  22-23
  2 结果  23-26
  3 讨论  26-29
第三部分硫酸镍对小鼠精原细胞Bax和Caspase3 mRNA和蛋白表达的影响  29-39
  1 材料与方法  29-33
  2 结果  33-35
  3 讨论  35-39
参考文献  39-45
英文缩略词表  45-47
致谢  47

硫酸镍对小鼠精原细胞Bax和Caspase3 mRNA和蛋白表达的影响

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