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鲤鱼MHC恒定链的鉴定及组织蛋白酶对其剪切作用

作　者: 寇闯
导　师: 蔡中华
学　校: 清华大学
专　业: 生物学
关键词: 抗原呈递 MHC恒定链恒定链类似蛋白组织蛋白酶鲤鱼
分类号: Q55
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

哺乳动物MHC(主要组织相容性复合物)II结合的恒定链在抗原呈递过程中对MHC II的功能调控起着重要的作用。恒定链合成后先形成三聚体,与新合成的MHC II类分子αβ异二聚体结合形成九聚体并指导其正确折叠。在内体中,恒定链被多种酶逐级剪切,组织蛋白酶在其中发挥了重要的作用,最终恒定链片段从MHC IIαβ异二聚体中释放,使MHC II能与抗原肽结合并将其呈递至细胞表面。目前发现多数鱼类体内存在两条恒定链同源类似物,被命名为Iclp(恒定链类似蛋白)-1和Iclp-2,哪一条在行使恒定链功能还没有确定。本课题根据GenBank提供的序列重组表达出鲤鱼的两条Iclp蛋白,并制备了相应的多克隆抗体。在对免疫相关组织进行检测后发现头肾,鳃,肝胰脏,脾脏中均有Iclp-1蛋白表达,其中头肾中有两条Iclp-1片段出现,其余均只有单一条带,而Iclp-2未在任何组织中检测到。体外剪切实验证明rIclp-1经剪切后可以产生与头肾中较小片段对应的肽段。由此我们认为Iclp-1是鲤鱼体内真正的恒定链。同时本课题还研究了鲤鱼组织蛋白酶在抗原呈递过程中的作用。在对rIclp-1蛋白进行体外剪切实验时发现,组织蛋白酶活性被完全抑制后,剪切效率明显下降,但没有被完全抑制,加入组织蛋白酶L抗体同样可以降低剪切效率。对参与抗原呈递的巨噬细胞进行检测,发现Iclp-1较大片段在减少而较小片段消失,加入组织蛋白酶抑制剂之后,Iclp-1与空白组相比基本没有变化。表明组织蛋白酶在抗原呈递过程中参与对Iclp-1的剪切过程。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
第1章前言  9-21
  1.1 抗原呈递的原理  9-10
  1.2 抗原呈递细胞  10
  1.3 主要组织相容性复合物  10-13
  1.4 抗原呈递过程  13-15
  1.5 恒定链在抗原呈递过程中的作用  15-19
  1.6 鱼类恒定链研究进展  19
  1.7 本课题的研究意义  19-21
第2章材料与方法  21-37
  2.1 实验动物与试剂  21-22
    2.1.1 实验动物  21
    2.1.2 试剂  21-22
    2.1.3 主要仪器  22
  2.2 实验材料与方法  22-37
    2.2.1 鲤鱼RNA 提取  22
    2.2.2 鲤鱼cDNA 的合成  22-23
    2.2.3 鲤鱼Iclp-1，Iclp-2 及Cathepsin L 基因的克隆  23-24
    2.2.4 PCR 产物纯化  24
    2.2.5 DNA 片段的连接  24
    2.2.6 感受态细胞的制备  24-25
    2.2.7 T 连接产物的转化  25-26
    2.2.8 质粒的提取  26
    2.2.9 质粒的酶切鉴定  26-27
    2.2.10 粘末端DNA 片断的连接  27
    2.2.11 转化及重组子的筛选  27
    2.2.12 重组蛋白最佳诱导表达时间的确定  27
    2.2.13 变性条件下重组蛋白的纯化  27-28
    2.2.14 纯化包涵体  28-29
    2.2.15 SDS-PAGE 电泳  29-30
    2.2.16 多克隆抗体的制备  30-31
    2.2.17 兔血清抗体纯化  31
    2.2.18 间接法ELISA 检验抗体效价  31-32
    2.2.19 鲤鱼组织中两种Iclp 蛋白的Western Blotting 检测  32-34
    2.2.20 鲤鱼头肾中组织蛋白酶活性检测  34
    2.2.21 组织裂解液对rIclp 的剪切作用  34
    2.2.22 鲤鱼巨噬细胞分离培养  34-35
    2.2.23 LPS 刺激后巨噬细胞中Iclp m RNA 水平表达变化  35-36
    2.2.24 吞噬后巨噬细胞中Iclp 状态检测及组织蛋白酶活性检测  36-37
第3章鲤鱼体内恒定链的鉴定  37-46
  3.1 鲤鱼Iclp-1 及Iclp-2 基因的重组表达及纯化  37-38
  3.2 多克隆抗体效价  38-40
  3.3 LPS 刺激后巨噬细胞中Iclp 表达量变化  40-41
  3.4 鲤鱼组织中Iclp 蛋白的检测  41
  3.5 rIclp 蛋白被头肾组织裂解液剪切情况  41-43
  3.6 讨论  43-46
第4章组织蛋白酶对Iclp-1 的剪切作用  46-55
  4.1 鲤鱼组织蛋白酶L 的重组表达  46-47
  4.2 鲤鱼组织蛋白酶L 的抗体制备  47
  4.3 鲤鱼组织蛋白酶L 的组织分布检测  47-48
  4.4 鲤鱼头肾中组织蛋白酶总活性检测  48-50
  4.5 组织蛋白酶对rIclp-1 的剪切  50-51
  4.6 巨噬细胞内组织蛋白酶对Iclp-1 的剪切作用  51-52
  4.7 巨噬细胞抗原呈递过程中组织蛋白酶活性变化  52-53
  4.8 讨论  53-55
参考文献  55-60
致谢  60-61
个人简历  61

鲤鱼MHC恒定链的鉴定及组织蛋白酶对其剪切作用

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