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两种来源乳杆菌的分离鉴定及遗传多态性研究

作　者: 张杨
导　师: 孟祥晨
学　校: 东北农业大学
专　业: 畜产品加工
关键词: 乳杆菌分离鉴定 16S rDNA序列 PCR-RFLP DGGE 遗传多态性
分类号: TS201
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

乳杆菌属（Lactobacillus）是乳酸菌中最大的一个属,也是乳酸菌中对食品工业最为重要、最常见和应用最广泛的一个属。作为益生菌,乳杆菌以其优良的益生作用而受到广泛的关注。我国蔬菜资源丰富,酸菜作为一种传统的乳酸发酵蔬菜制品,其汁液中富含乳酸菌活菌,其中尤以短乳杆菌和植物乳杆菌占优势。另外,乳酸菌也是猪消化道前段的优势菌群,自然存在于猪肠道正常菌群的乳酸杆菌有:嗜酸乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、短乳杆菌、纤维二糖乳杆菌、发酵乳杆菌、唾液乳杆菌,其中最主要的是嗜酸乳杆菌和罗伊氏乳杆菌。乳杆菌的传统鉴定方法主要是依赖乳杆菌的表型特征,尽管这些方法依然是目前鉴定乳杆菌的主要方法,但更多的研究显示,对乳杆菌准确分类还需要进行基因水平上的鉴定。单纯的依靠表型特征试验易造成乳杆菌鉴定结果不准确,故必须结合分子生物学鉴定结果才能对乳杆菌进行准确鉴定。本研究的主要研究内容为分离植物源和动物源的乳杆菌,并对其进行鉴定和遗传多态性分析。本研究主要取得如下研究结果:1.乳杆菌的分离纯化及菌种保存以自然发酵的优良东北酸菜和猪肠道内容物为样品,以改良MRS培养基为分离培养基,厌氧条件培养,对这两种来源的乳杆菌进行分离、纯化以及菌株保藏。并通过形态学特征和过氧化氢酶试验,初步确定从酸菜样品和猪肠道样品中分别分离得到乳杆菌39株和29株。2.乳杆菌的生理生化鉴定通过明胶液化试验、吲哚试验、H₂S产生试验、硝酸盐还原试验进一步验证所分离的菌株,结果显示从酸菜样品和猪肠道样品分离得到的菌株中分别有34和25株属于乳杆菌属:对分离自酸菜的L1～L10株,以及分离自猪肠道的L10～L20株进行糖发酵实验,通过它们对单糖、二糖、多糖以及糖苷和糖醇类等碳水化合物的利用情况初步确定其种。3.利用16S rDNA的序列聚类分析鉴定乳杆菌使用一对乳酸菌特异性引物扩增分离株L1～L20的16S rDNA序列,得到大小为1500bp左右的16S rDNA片段,然后进行测序。将分离株的测序结果与参比菌株的序列进行比对,得出他们之间的相似百分比,同时结合糖发酵结果确定这20株菌为:干酪乳杆菌1株、短乳杆菌4株、棒状乳杆菌1株、植物乳杆菌3株和米酒乳杆菌1株:罗伊氏乳杆菌4株、约氏乳杆菌2株、嗜酸乳杆菌2株、发酵乳杆菌1株、唾液乳杆菌1株。4.利用PCR-RFLP技术研究乳杆菌的遗传多态性用3种限制性内切酶XbaⅠ、MspⅠ和AluⅠ分别消化分离株L1～L20的16S rDNA,其中MspⅠ酶和AluⅠ酶产生丰富的酶切图谱,将L1～L20分成了10个遗传型,表明分离株具有遗传多态性特征。5.利用PCR-DGGE技术区分不同种的乳杆菌使用一对乳酸菌的特异性引物扩增L1～L20的V7～V8高可变区,变性梯度凝胶电泳的结果证明这种方法能够区分不同种的分离株,其结果与传统方法以及16s rDNA的序列聚类分析的结果相一致。本研究从两种来源样品中分离得到59株乳杆菌,并将其中的20株分离菌株鉴定到种水平,为进一步研究和应用奠定了基础:另外还分析了几种分子生物学方法在乳杆菌鉴定和区分中的作用,为以后系统化鉴定乳杆菌提供了依据。

全文目录

中文摘要  8-10
英文摘要  10-12
1 前言  12-22
  1.1 乳杆菌属的概述  12
  1.2 乳酸菌在生产中的重要意义  12-15
    1.2.1 乳酸菌在植物制品生产中的意义  12-14
    1.2.2 乳酸菌作为益生菌制品的意义  14-15
  1.3 乳杆菌鉴定技术进展  15-18
    1.3.1 传统鉴定方法  15-16
    1.3.2 快速鉴定技术  16
    1.3.3 分子生物学鉴定技术  16-18
  1.4 乳杆菌遗传多态性研究技术的进展  18-20
    1.4.1 PCR-RFLP技术  18-19
    1.4.2 随机扩增多态性DNA技术  19-20
    1.4.3 DGGE技术  20
  1.5 本研究的目的与意义  20-21
  1.6 本研究的主要内容  21-22
2 材料与方法  22-32
  2.1 试验材料  22-25
    2.1.1 用于分离乳杆菌的样品  22-23
    2.1.2 培养基  23
    2.1.3 重要试剂  23-24
    2.1.4 主要溶液及其配制  24-25
    2.1.5 引物  25
    2.1.6 标准菌株及来源  25
  2.2 仪器与设备  25-26
  2.3 试验方法  26-32
    2.3.1 乳杆菌的分离与纯化  26-27
    2.3.2 分离菌株的生理生化试验  27
    2.3.3 部分分离株的形态观察  27
    2.3.4 部分分离菌株的16S rDNA序列聚类分析  27-29
    2.3.5 利用16S rDNA PCR-RFLP技术研究分离菌株的遗传多态性  29-30
    2.3.6 利用PCR-DGGE技术区分乳杆菌  30-32
3 结果与分析  32-55
  3.1 乳杆菌的分离与纯化  32
  3.2 分离株的生理生化试验结果  32-33
  3.3 部分分离株的形态学特征  33-35
    3.3.1 菌落特征  33-34
    3.3.2 菌体特征  34-35
  3.4 部分分离菌株的16S rDNA序列聚类分析结果  35-49
    3.4.1 DNA提取与模板制备  35
    3.4.2 16S rDNA扩增结果  35-36
    3.4.3 16S rDNA测序结果  36-37
    3.4.4 16S rDNA序列的聚类分析结果  37-49
  3.5 16S rDNA PCR-RFLP技术研究部分分离菌株遗传多态性的结果  49-51
    3.5.1 16S rDNA PCR-RFLP结果  49-51
    3.5.2 16S rDNA PCR-RFLP遗传型分析  51
  3.6 利用PCR-DGGE技术区分乳杆菌的结果  51-55
    3.6.1 PCR产物的琼脂糖电泳检测结果  51-52
    3.6.2 DGGE结果  52-55
4 讨论  55-58
  4.1 培养基及培养条件对乳杆菌分离效果的影响  55
  4.2 酸菜与猪肠道中的菌群状况  55
  4.3 传统方法与16S rDNA序列聚类分析法的比较与分析  55-56
  4.4 16S rDNA PCR-RFLP方法的启示  56
  4.5 PCR-DGGE分析结果的启示  56-58
5 结论  58-59
致谢  59-60
参考文献  60-66
附录  66-70
攻读学位期间发表的学术论文  70

两种来源乳杆菌的分离鉴定及遗传多态性研究

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