学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

GNA单克隆抗体的制备及在检测GNA转基因大豆方面的应用

作　者: 董春光
导　师: 王兴智
学　校: 东北师范大学
专　业: 遗传学
关键词: 单克隆抗体转基因植物检测间接ELISA法 Western Blot法
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 121次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

雪花莲凝集素(GNA)是植物凝集素家族中非常重要的一员。GNA单体由109个氨基酸组成,分子量为12kDa,天然的GNA是一个由四个单体以非共价结合而形成的一个分子量为50kDa多聚体糖蛋白。GNA可以专一识别甘露糖,并通过破坏昆虫中肠的表皮细胞从而达到杀虫的目的。GNA对刺吸式口器的害虫和某些咀嚼式口器的害虫及多种线虫均有较好的毒杀效果,如蚜虫、稻飞虱、叶蝉等,可以部分弥补BT的杀虫图谱,近年来引起了科学家的广泛关注,越来越多种植物被转入了GNA的基因。随着转基因植物突飞猛进的发展,转基因植物以及转基因食品安全性的问题越来越受到人们的关注。本实验制备了抗GNA的单克隆抗体,并把它用于对GNA转基因大豆的检测。首先用从SIGMA公司购得的GNA纯品免疫BALB/c小鼠,每次8μg,共免疫4次。加强免疫后第四天取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合。融合率为5%,阳性率为20.8%。通过4次有限稀释克隆获得了一株抗GNA的杂交瘤细胞株,命名为2D8。以GNA纯品通过Western Blot法和间接ELISA法对单抗2D8进行检测,证明了单抗2D8确实是与GNA蛋白特异性结合的。用间接ELISA法测定腹水的效价为1:400。用改良的CTAB法提取GNA转基因大豆的基因组DNA,以根据GNA的全长序列设计的引物进行PCR反应,以非转基因大豆基因组作为阴性对照,证明了GNA转基因大豆中确实整合了GNA的基因。提取GNA转基因大豆的可溶性蛋白,用单抗2D8对其进行间接ELISA法检测,并以非转基因大豆的可溶性蛋白作为阴性对照,结果证明了GNA转基因大豆确实表达了GNA蛋白,并测得其表达的GNA蛋白占其可溶性蛋白的0.1%左右。进一步利用单抗2D8对GNA转基因大豆的可溶性蛋白进行了Western Blot法检测,同样以非转基因大豆的可溶性蛋白作为阴性对照,也在GNA转基因大豆中检测到了转入GNA基因的表达。这些结果都为我们建立一套可以在蛋白水平上,更快捷更准确的对转基因植物进行检测的方法提供了基础。

全文目录

中文摘要  4-5
英文摘要  5-8
1. 引言  8-11
  1.1 雪花莲凝集素（GNA）概述  8-9
    1.1.1 植物凝集素  8
    1.1.2 雪花莲凝集素  8-9
    1.1.3 雪花莲凝集素的生物学功能  9
  1.2 GNA 转基因植物的检测  9-10
    1.2.1 GNA 转基因植物检测的现状  9
    1.2.2 单克隆抗体技术原理  9
    1.2.3 间接法 ELISA 技术原理  9-10
    1.2.4 Western Blot 法技术原理  10
  1.3 立题依据  10-11
2. 材料和方法  11-17
  2.1 材料  11
    2.1.1 动物材料  11
    2.1.2 细胞株  11
    2.1.3 化学试剂  11
    2.1.4 引物  11
    2.1.5 培养基  11
  2.2 实验方法  11-17
    2.2.1 GNA 单克隆抗体的制备  11-15
      2.2.1.1 BALB/c 小鼠的免疫  11-12
      2.2.1.2 间接 ELISA 法检测BALB/c 鼠的免疫效果  12
      2.2.1.3 GNA 单克隆抗体的制备  12-15
        2.2.1.3.1 骨髓瘤细胞NS-1 和BALB/c 小鼠抗体分泌脾细胞的融合  12-13
        2.2.1.3.2 杂交瘤细胞的检测  13-14
        2.2.1.3.3 杂交瘤细胞的有限稀释法克隆  14
        2.2.1.3.4 杂交瘤细胞的扩大培养  14
        2.2.1.3.5 GNA 单克隆抗体的腹水的制备  14-15
        2.2.1.3.6 GNA 单克隆抗体的腹水效价的检测  15
        2.2.1.3.7 GNA 单克隆抗体的亚型鉴定  15
    2.2.2 GNA 转基因大豆的检测  15-17
      2.2.2.1 PCR 法检测 GNA 转基因大豆  15-16
        2.2.2.1.1 改良的CTAB法提取大豆的基因组DNA  15
        2.2.2.1.2 对 GNA 转基因大豆的基因组进行 PCR 检测  15-16
      2.2.2.2 大豆可溶性蛋白的提取  16
      2.2.2.3 间接ELISA法检测  16
      2.2.2.4 Western Blot 法检测  16-17
3. 结果  17-22
  3.1 GNA 抗体的制备  17-19
    3.1.1 BALB/c 小鼠的免疫效果  17
    3.1.2 GNA 抗体血清效价的检测  17
    3.1.3 GNA 杂交瘤细胞株的建立  17-18
    3.1.4 GNA 单克隆抗体效价的检测  18
    3.1.5 GNA 单克隆抗体的亚型鉴定  18-19
  3.2 GNA 转基因大豆的检测  19-22
    3.2.1 改良的CTAB法提取大豆的基因组DNA  19
    3.2.2 对 GNA 转基因大豆的基因组进行 PCR 检测  19
    3.2.3 间接ELISA法检测  19-20
    3.2.4 Western Blot 法检测  20-22
4. 讨论  22-24
  4.1 抗体的制备  22
  4.2 DNA 水平上的检测  22-23
  4.3 蛋白水平上的检测  23-24
5. 结论  24-25
参考文献  25-29
致谢  29

GNA单克隆抗体的制备及在检测GNA转基因大豆方面的应用

内容摘要

全文目录

相似论文