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一种新的抗病毒分子HIRRP的相互作用蛋白筛选、验证及生物学功能分析

作　者: 唐松青
导　师: 李琦涵；刘龙丁；董承红
学　校: 中国协和医科大学
专　业: 免疫学
关键词: 抗病毒作用酵母双杂交技术重组质粒 HIRRP 免疫共沉淀红色荧光蛋白 NADH 生物学功能融合蛋白北京协和医学院研究生学位论文文库 cDNA 自激活作用酵母表达病毒基因感受态细胞复发性感染 RNA 包涵体
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

Ⅰ型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type 1, HSV-1)主要诱发口咽部疱疹,引起口腔粘膜溃疡、水泡状病变、水肿等,病程一般为2-3周,疾病痊愈后病毒可进入潜伏状态,一旦机体免疫力下降,该潜伏状态的病毒便能反复引起复发性感染。这种复发性感染的策略,一方面可能是HSV-Ⅰ通过进化对宿主产生了近乎完美的适应,另一方面也表明宿主在进化过程中可能形成了针对HSV-Ⅰ感染的较为理想的控制模式。因此,HSV-Ⅰ感染的细胞可作为一种理想的研究细胞抗病毒方式的模式细胞之一。单纯疱疹病毒Ⅰ型感染相关抑制蛋白(HSV-1 infection related repress protein, HIRRP)是一个结构和功能仍未见报道过的蛋白。我们前期的工作发现HIRRP能在HSV-Ⅰ感染的L02细胞内高表达,表明HIRRP可能参与了细胞抗病毒感染这一重要的生物学事件。Northern blot显示HIRRP在未感染细胞的G0/G1期、S期均有低水平的组成性表达；半衰期理论预测显示HIRRP具有较长的半衰期(30 h),表明HIRRP的调控方式可能是存在于转录水平,从经济原则角度来说,这种调控方式可能与机体应对病毒感染这种低概率事件是相协调、相一致的。然而,HIRRP在细胞内参与抗病毒感染的具体作用机理仍不清楚。为此,我们以HIRRP为诱饵构建了pGBKT7-HIRRP载体,用酵母双杂交技术从人肝细胞cDNA 文库中筛选出了多种可能与HIRRP发生相互作用的候选蛋白,如玻连蛋白(Vitronectin,VTN)、活化转录因子5 (activating transcription factor 5,ATF-5)、COX2、COX3、NADH1、NADH4等,其中VTN引起了我们较浓厚的兴趣。之前的研究表明VTN作为一种细胞外基质的主要成分,参与了促细胞黏附、迁移、生长、存活、增殖、分化以及凝血和纤溶等多种生物学事件,但有关VTN是否在细胞内也存在某种生物学功能却未见报道过。因此,我们以VTN这种多功能蛋白为研究重点,通过体内免疫共沉淀和双荧光共定位实验,以及体外的促细胞增殖实验和细胞抗病毒实验,证实了HIRRP和VNT之间存在着相互作用。初步的功能也分析显示,两者的相互作用,具有协同促进细胞抗病毒的效应。由此,我们得出结论,HIRRP和VNT在细胞内能发生相互作用,并猜测这种作用与细胞的抗病毒感染活动相关。

全文目录

中文摘要  4-5
英文摘要  5-6
前言  6-12
一.实验材料与方法  12-30
  (一) 实验材料  12-16
  (二) 实验方法  16-30
二.实验结果  30-39
  (一) HIRRP诱饵蛋白表达载体及实验中用到的各种载体的构建  30
  (二) 诱饵蛋白pGBKT7-HIRRP和猎物蛋白pGADT7-VTN的细胞毒性以及自激活检测  30-31
  (三) 酵母双杂交结果  31-32
  (四) β半乳糖苷酶活性检测HIRRP与VTN的作用强弱  32
  (五) HIRRP的表达纯化及抗体制备  32-34
  (六) 胞内免疫共沉淀证实HIRRP与VTN直接相互作用  34-35
  (七) HIRRP及VTN在CHO细胞中的双荧光共定位  35-36
  (八) 外源融合蛋白HIRRP-GST与VTN-GST对细胞增殖的影响  36
  (九) 外源融合蛋白HIRRP-GST与VTN-GST对HSV-1入胞过程的的影响  36-37
  (十) 上调VTN与HIRRP的表达水平对HSV-1基因转录水平的影响  37-39
三. 讨论  39-41
参考文献  41-45
论文综述  45-53
附录一缩略词  53-55
附录二主要溶液的配制  55-62
致谢  62-63
研究生简历  63-64

一种新的抗病毒分子HIRRP的相互作用蛋白筛选、验证及生物学功能分析

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