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丹参酮ⅡA多剂型的体内筛选和体外代谢研究

作　者: 丁建刚
导　师: 高允生；窦桂芳
学　校: 泰山医学院
专　业: 药理学
关键词: 丹参酮ⅡA LC-MS/MS 代谢稳定性 代谢表型 生物利用度 血浆蛋白结合率 生物转化
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的本研究旨在通过建立LC-MS/MS方法对丹参中的一个单体成分—丹参酮ⅡA—采用制剂新技术获得的多个剂型进行生物利用度比较研究,期望获得高生物利用度的新剂型,并对其进行体外代谢研究,对代谢产物进行结构解析,期望获得活性代谢产物,预测药物相互作用,提高临床用药的安全性。方法(1)建立LC-MS/MS方法,采用4*4交叉试验设计,减少实验误差,采用比格犬作为实验动物,分别对粉末、口服液、胶囊、注射剂等剂型进行生物利用度比较研究。(2)用SD大鼠混合肝微粒体P450单一酶对丹参酮ⅡA进行了代谢稳定性研究,采用96孔板进行反应和孵育、叔丁基甲醚萃取和96孔板离心的样品处理方法、LC-MS/MS检测等手段,得到了丹参酮ⅡA新剂型在体外被肝微粒体代谢的消除半衰期、清除率等信息。(3)采用NADPH、FMO抑制剂、P450各亚型抑制剂等方法,采用乙腈沉淀蛋白的样品处理方法进行了代谢表型研究(4)采用平衡透析的方法,对丹参酮37℃进行孵育18h后,利用LC-MS液质联用仪进行了血浆蛋白结合率的研究(5)采用LC-MSn离子阱技术,对丹参酮ⅡA的多级质谱进行研究,对其结构断裂途径进行推测,利用SD大鼠肝微粒体孵育方式,对丹参酮ⅡA在体外的生物转化进行了研究。(6)实验数据分别采用统计矩法、DAS、3P97、winnonlon软件对比进行了药代参数的计算,最终采用统计矩法分析,统计分析采用SAS8.2统计软件。结果四次给药后,超微粉悬液组、口服液组、丹参酮胶囊组(4mg·kg-1)的药物生物利用度F依次为5.4±0.61%,7.3±0.87%,5.6±1.5%,经过统计分析,两两之间没有统计学差异,但口服液组的的生物利用度要高于其他两组;代谢稳定性:t1/2体外代谢稳定,与其在比格犬血浆中的半衰期较长一致,清除率相关性较好;代谢表型研究发现有TS代谢途径主要有CYP3A2、CYP2E1、CYP2C11、CYP2D1几种方式;TS血浆蛋白结合率均较高,大于95%。且该药的结合率与药物浓度无关;在肝微粒体发现了10种主要代谢产物,并进行了初步推测。结论通过对丹参酮ⅡA的代谢稳定性、代谢表型、蛋白结合率和生物转化研究,了解丹参酮ⅡA的代谢特点,促进临床用药的安全有效性。

全文目录


中文摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
符号说明  11-12
前言  12-14
第一部分 定量生物样品的LC/MS~2分析方法的建立  14-26
  1、仪器与材料  14
    1.1 药品与试剂  14
    1.2 实验仪器  14
  2、溶液的配制和标准曲线的制备  14-15
    2.1 TS 标准溶液的配制  14-15
    2.2 内标溶液的配制  15
    2.3 0.1%甲酸甲醇配制  15
    2.4 5mmol·L~(-1) 的甲酸铵缓冲盐溶液的配制  15
    2.5 标准曲线的制备  15
  3、试验方法  15-19
    3.1 色谱条件  15-16
    3.2 质谱条件  16
    3.3 样品测定  16
    3.4 样品的预处理方法  16
    3.5 分析方法的确证  16-19
  4、结果  19-23
    4.1 分析方法的专属性  19-20
    4.2 标准曲线  20-21
    4.3 精密度和准确度  21-22
    4.4 绝对回收率  22
    4.5 稳定性  22-23
    4.6 稀释效应  23
    4.7 基质效应  23
  5 分析方法的实施  23-25
  讨论  25
  结论  25-26
第二部分 丹参酮ⅡA 多剂型生物利用度研究  26-42
  1 实验材料  26
    1.1 试剂和仪器  26
    1.2 实验动物  26
  2 实验方法  26-27
    2.1 给药溶液的配制  26
    2.2 试验设计  26-27
    2.3 样品分析  27
    2.4 数据处理  27
  3 试验结果  27-39
  4 统计分析  39-40
  讨论  40-41
  结论  41-42
第三部分 代谢稳定性研究  42-51
  1 材料与方法  42-43
    1.1 药品与试剂  42-43
    1.2 实验仪器  43
    1.3 实验动物  43
  2 实验方法  43-47
    2.1 SD 大鼠混合肝微粒提取  43-44
    2.2 肝微粒体孵育  44-45
    2.3 色谱条件  45-46
    2.4 质谱条件  46
    2.5 in vitro T_(1/2) 法求算CL_(int)  46-47
    2.6 数据分析方法  47
  3、结果  47-50
    3.1 提取微粒体的质量鉴定  47
    3.2 图谱  47-48
    3.3 微粒体的代谢活性鉴定  48-49
    3.4 TS 在SD 大鼠微粒体中的消除  49-50
  讨论  50
  结论  50-51
第四部分 代谢表型研究  51-58
  1 实验材料  51
    1.1 药品与试剂  51
    1.2 仪器与设备  51
  2 实验方法  51-53
    2.1 研究思路  51-52
    2.2 实验步骤  52-53
    2.3 色谱质谱条件  53
    2.4 数据处理  53
  3 结果  53-56
    3.1 代谢转化是否依赖与NADPH  53-54
    3.2 P450 和FMO 对代谢转化的作用  54
    3.3 SD 大鼠肝微粒体中与TS 代谢有关的P450 酶的鉴定  54-56
  讨论  56-57
  结论  57-58
第五部分 丹参酮ⅡA 的血浆蛋白结合率研究  58-63
  1 实验材料  58
    1.1 药品和试剂  58
    1.2 仪器设备  58
  2 实验方法  58-59
    2.1 血浆蛋白结合率实验设计  58-59
    2.2 生物样品的预处理  59
    2.3 标准曲线的建立  59
    2.4 色谱质谱条件  59
    2.5 数据处理  59
  3 实验结果  59-62
    3.1 标准曲线  59-60
    3.2 血浆蛋白结合率试验结果  60-62
  讨论  62
  结论  62-63
第六部分 丹参酮ⅡA 的体外生物转化研究  63-74
  1 实验材料  63
    1.1 药品和试剂  63
    1.2 实验仪器  63
    1.3 实验动物  63
    1.4 溶液配制  63
  2 实验方法  63-64
    2.1 TS 孵育样品制备  63-64
    2.2 样品的前处理  64
    2.3 ESI-MS~n 分析条件与方法  64
    2.4 LC/MS~n 分析条件与方法  64
  3 实验结果  64-73
    3.1 TS 标准溶液的LC/MS~n 和ESI-MS~n 分析结果  64-67
    3.2 SD 大鼠肝微粒体样品的LC/MS~n 分析结果  67-72
    3.3 代谢转化途径分析  72-73
  讨论  73
  结论  73-74
总结  74-76
参考文献  76-80
综述  80-92
  参考文献  88-92
致谢  92-93
攻读硕士学位期间发表的学术论文  93

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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