学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

生物转化法生产β-丙氨酸的研究

作 者: 楼坚
导 师: 裘娟萍
学 校: 浙江工业大学
专 业: 生物化工
关键词: HPLC-ELSD 藤黄八叠球菌 生物转化 诱变 优化 壳聚糖 固定化
分类号: TQ922.2
类 型: 硕士论文
年 份: 2006年
下 载: 34次
引 用: 0次
阅 读: 论文下载
 

内容摘要


本论文通过对纸层析法、高锰酸钾滴定法和高效液相色谱的比较,建立了HPLC-ELSD直接检测β-丙氨酸的新方法。该方法色谱条件为:色谱柱为5μm Alltech氨基柱,柱温为40℃,流动相为甲醇:水=5:1,流速为1.0mL/min,检测器为蒸发光散射检测器Alltech2000(U.S.A.),检测器工作条件为飘移管温度85℃,气体流速2.2L/min。从全国8个地点采集土壤,筛选到26株耐丙烯酸菌株。将26株菌株和藤黄八叠球菌(Sarcine luted)同时发酵、转化后比较产β-丙氨酸合成酶能力,结果藤黄八叠球菌转化得到的β-丙氨酸含量为0.102g/L,高于其他26株菌株。对藤黄八叠球菌进行(60)Coγ射线诱变和紫外诱变,在高浓度丙烯酸培养基和发酵残液培养基上培养,筛选得到β-丙氨酸合成酶产生菌TH0517A,β-丙氨酸合成酶活力为20.5U,较诱变前提高酶活28.97%。采用单因素及正交实验法,对诱变株TH0517A酶合成条件进行优化,优化后的酶合成条件:可溶性淀粉2.3g,硝酸钾0.8g,H3BO33.4μg,ZnSO4 8.1μg,MgSO4·7H2O 0.02g,KH2PO4 0.7g,NaCl 0.145g,定容100mL,NaOH调pH 7.0,发酵温度30℃,转速200 r/min,发酵时间18h。通过对酶合成条件的优化,突变株TH0571A酶活达到了54.4U,较优化前提高了200.41%。对转化工艺条件进行单因素优化实验,优化后的工艺条件为:二级发酵液发酵完毕后,直接作为酶液使用;转化液配方:6%丙烯酸,1%10-5mol/LZnSO4,1%10-5mol/L CuSO4,0.02%MgSO4.7H2O,配置方法:添加丙烯酸后,用0.1%Ca(OH)2调节pH值至7.0,冷却至室温,然后添加各种离子,最后氨水调pH值至10.0。转化时每15mL转化液添加9mL发酵液,30℃转化10h。实验结果显示,突变株TH0571A转化率达到了1.25%,较优化前提高了138%。采用戊二醛交联壳聚糖固定化方法,对β-丙氨酸合成酶进行固定。将壳聚糖凝胶与质量分数为0.4%的戊二醛混合,室温下搅拌交联3h,水洗至无戊二醛,以每克干壳聚糖添加40mL酶液将粗酶液添加到交联好的壳聚糖凝胶中,0℃固定化2h,抽滤洗涤后即得固定化β-丙氨酸合成酶。该方法酶活回收率达到43.16%。

全文目录


摘要  4-6
Abstract  6-16
第一章 综述  16-30
  1.1 β-丙氨酸的理化性质  16-17
  1.2 β-丙氨酸在生物体内的主要合成代谢途径  17-21
    1.2.1 β-丙氨酸在不同生物中的代谢  18-21
      1.2.1.1 微生物体内的代谢  18-20
      1.2.1.2 动物体内的代谢  20-21
      1.2.1.3 植物体内的代谢  21
  1.3 β-丙氨酸的生理功能  21-23
    1.3.1 合成泛酸、肌肽等物质  22
    1.3.2 SNCD系统中一种有效的神经传递素  22
    1.3.3 N-β-丙氨酰多巴胺(NBAD)的前体  22-23
    1.3.4 神经传导抑制结构类似物  23
  1.4 β-丙氨酸的主要应用  23-26
    1.4.1 肌肽  23-24
    1.4.2 氟化甲基β-丙氨酸衍生物  24
    1.4.3 喜树碱β-丙氨酸酯  24
    1.4.4 聚β-丙氨酸  24-25
    1.4.5 泛酸钙的合成  25
    1.4.6 人工合成糖配基库  25
    1.4.7 β-丙氨酸金属配合物  25-26
  1.5 β-丙氨酸的生产  26-28
    1.5.1 丙烯腈法  26
    1.5.2 β-氨基丙腈法  26-27
    1.5.3 琥珀酰亚胺(丁二酰亚胺)降解法  27
    1.5.4 丙烯酸法  27-28
  1.6 选题背景和意义  28-30
第二章 分析方法的建立  30-43
  2.1 材料与方法  30-34
    2.1.1 材料  30-31
    2.1.2 仪器设备  31
    2.1.3 方法  31-34
      2.1.3.1 纸层析法定性分析产物β-丙氨酸  31
      2.1.3.2 酸性高锰酸钾滴定法定量分析底物丙烯酸  31-32
      2.1.3.3 HPLC-ELSD法测定β-丙氨酸  32-33
      2.1.3.4 离子交换法样品预处理  33-34
  2.2 结果与讨论  34-40
    2.2.1 纸层析法定性分析产物β-丙氨酸  34-35
    2.2.2 酸性高锰酸钾滴定法定量分析底物丙烯酸  35-36
      2.2.2.1 0.1mol/L高锰酸钾溶液的配制及标定  35-36
      2.2.2.2 高锰酸钾滴定标准曲线  36
    2.2.3 HPLC-ELSD法测定β-丙氨酸  36-40
      2.2.3.1 标样β-丙氨酸测定  36-37
      2.2.3.2 流动相的选择  37
      2.2.3.3 HPLC-ELSD测定β-丙氨酸的标准曲线  37-39
      2.2.3.4 HPLC-ELSD测定β-丙氨酸的回收率  39
      2.2.3.5 样品预处理中β-丙氨酸的回收率  39-40
      2.2.3.6 β-丙氨酸转化率计算方法  40
  2.3 本章小结  40-43
    2.3.1 纸层析法定性分析产物β-丙氨酸  40-41
    2.3.2 酸性高锰酸钾滴定法定量分析底物丙烯酸  41
    2.3.3 高效液相色谱法测定β-丙氨酸  41-42
    2.3.4 小结  42-43
第三章 菌种选育  43-53
  3.1 材料与方法  43-47
    3.1.1 菌种来源  43
    3.1.2 土壤来源  43
    3.1.3 培养基及培养条件  43-45
      3.1.3.1 土壤筛选培养液  43
      3.1.3.2 斜面培养基及培养条件  43-44
      3.1.3.3 平板筛选培养基及培养条件  44
      3.1.3.4 摇瓶培养基及培养条件  44-45
    3.1.4 转化液配制  45
    3.1.5 主要材料  45
    3.1.6 主要仪器设备  45-46
    3.1.7 方法  46-47
      3.1.7.1 耐丙烯酸菌株的富集方法  46
      3.1.7.2 耐丙烯酸菌株的筛选  46
      3.1.7.3 转化方法  46
      3.1.7.4 耐丙烯酸菌株产物的检测  46-47
  3.2 结果与讨论  47-50
    3.2.1 耐丙烯酸菌株的富集  47-48
    3.2.2 耐丙烯酸菌株的筛选  48-49
    3.2.3 最佳菌株的确定  49-50
  3.3 本章小结  50-53
第四章 菌种诱变选育  53-64
  4.1 材料与方法  53-56
    4.1.1 菌种来源  53
    4.1.2 培养基及培养条件  53-54
      4.1.2.1 斜面培养基及培养条件  53
      4.1.2.2 平板筛选培养基及培养条件  53
      4.1.2.3 发酵残液培养基及培养条件  53
      4.1.2.4 摇瓶培养基及培养条件  53-54
    4.1.3 转化液配制  54
    4.1.4 主要材料  54
    4.1.5 主要仪器设备  54
    4.1.6 方法  54-56
      4.1.6.1 菌种活化  54
      4.1.6.2 出发菌的耐丙烯酸检测  54
      4.1.6.3 相对酶活的测定  54-55
      4.1.6.4 诱变处理  55
      4.1.6.5 ~(60)Coγ射线诱变  55
      4.1.6.6 紫外线诱变  55
      4.1.6.7 耐丙烯酸突变株的筛选  55
      4.1.6.8 突变株的稳定性考察  55-56
      4.1.6.9 分析方法  56
  4.2 结果与讨论  56-62
    4.2.1 出发菌耐丙烯酸的能力  56
    4.2.2 酶活计算  56-57
    4.2.3 诱变处理结果  57-62
      4.2.3.1 ~(60)Coγ射线诱变处理  57-60
      4.2.3.2 紫外线诱变结果  60-62
    4.2.4 突变株稳定性研究  62
  4.3 本章小结  62-64
第五章 酶合成条件的优化  64-79
  5.1 材料与方法  64-67
    5.1.1 菌种来源  64
    5.1.2 斜面培养基及培养条件  64
    5.1.3 摇瓶培养基及培养条件  64
    5.1.4 转化液配制  64
    5.1.5 主要材料  64
    5.1.6 主要仪器设备  64
    5.1.7 方法  64-67
      5.1.7.1 摇瓶发酵工艺的确定  65-66
      5.1.7.2 发酵培养基的优化  66-67
  5.2 结果与讨论  67-78
    5.2.1 摇瓶发酵工艺的优化  67-71
      5.2.1.1 生长曲线的绘制  67-68
      5.2.1.2 生长周期对产酶的影响  68
      5.2.1.3 转速对产酶的影响  68-69
      5.2.1.4 温度对发酵的影响  69
      5.2.1.5 底物丙烯酸对产酶影响  69-71
    5.2.2 发酵培养基的优化  71-78
      5.2.2.1 单因素实验  71-74
        5.2.2.1.1 碳源研究结果  71-72
        5.2.2.1.2 氮源研究结果  72-73
        5.2.2.1.3 无机盐实验  73-74
      5.2.2.2 正交实验  74-77
      5.2.2.3 最佳发酵条件优化组合的验证  77-78
  5.3 本章小结  78-79
第六章 转化酶促反应的初步研究  79-94
  6.1 材料与方法  79-83
    6.1.1 菌种来源  79
    6.1.2 斜面培养基及培养条件  79
    6.1.3 摇瓶培养基及培养条件  79
      6.1.3.1 一级种子培养基及培养条件  79
      6.1.3.2 二级发酵培养基及培养条件  79
    6.1.4 粗转化液配制  79
    6.1.5 主要材料  79-80
    6.1.6 主要仪器设备  80
    6.1.7 方法  80-83
      6.1.7.1 酶促转化反应的确定  80
      6.1.7.2 细胞破壁对酶活性的影响  80
      6.1.7.3 加酶量对转化反应的影响  80-81
      6.1.7.4 丙烯酸浓度对转化反应的影响  81
      6.1.7.5 氨水调不同pH值对转化反应的影响  81
      6.1.7.6 不同丙烯酸盐对转化反应的影响  81-82
      6.1.7.7 温度对转化反应的影响  82
      6.1.7.8 转化时间对转化反应得影响  82
      6.1.7.9 金属离子对转化反应的影响  82
      6.1.7.10 转化体系对转化反应的影响  82
      6.1.7.11 转化液自发反应产生β-丙氨酸的测定  82-83
  6.2 实验结果  83-92
    6.2.1 酶促转化反应的确定  83
    6.2.2 细胞破壁对产酶的影响  83-84
    6.2.3 加酶量对转化反应的影响  84-85
    6.2.4 丙烯酸浓度对转化率的影响  85
    6.2.5 不同pH值对转化反应的影响  85-86
    6.2.6 不同丙烯酸盐对转化反应的影响  86-88
    6.2.7 温度对转化反应的影响  88
    6.2.8 转化时间对转化反应的影响  88-89
    6.2.9 在转化液中添加不同的离子种类对转化率的影响  89-90
    6.2.10 不同底物添加剂对转化反应的影响  90-91
    6.2.11 转化液自发反应产生β-丙氨酸的测定  91-92
    6.2.12 转化条件的优化  92
  6.3 本章小结  92-94
第七章 固定化β-丙氨酸加氨酶的初步研究  94-102
  7.1 材料与方法  94-96
    7.1.1 菌种来源  94
    7.1.2 斜面培养基及培养条件  94
    7.1.3 摇瓶培养基及培养条件  94
      7.1.3.1 一级种子培养基及培养条件  94
      7.1.3.2 二级发酵培养基及培养条件  94
    7.1.4 转化液配制  94-95
    7.1.5 主要材料  95
    7.1.6 主要仪器设备  95
    7.1.7 方法  95-96
      7.1.7.1 酶液的置备  95
      7.1.7.2 固定化方法的确定  95-96
      7.1.7.3 以壳聚糖为载体的酶固定化方法优化  96
  7.2 结果与分析  96-100
    7.2.1 固定化方法的选择  96-98
    7.2.2 戊二醛质量浓度的确定  98
    7.2.3 最优化的固定化条件的确定  98-100
  7.3 本章小结  100-102
第八章 展望  102-104
参考文献  104-110
致谢  110-111
攻读学位论文期间发表的学术论文目录  111

相似论文

  1. 超声波钎焊填缝及钎缝优化工艺研究,TG454
  2. 曲拉精制干酪素褐变因素及工艺优化研究,TS252.5
  3. 压气机优化平台建立与跨音速压气机气动优化设计,TH45
  4. 常温低温组合密封结构的有限元分析与优化设计,TH136
  5. 涡轮S2流面正问题气动优化设计研究,V235.11
  6. 基于蚁群算法的电梯群优化控制研究,TU857
  7. 中心回燃式燃烧室燃烧特性研究,TK223.21
  8. 内置式高效永磁同步电机的设计研究,TM341
  9. 内点法在大型电力系统无功优化中的应用研究,TM714.3
  10. 轴向磁通感应子式高温超导电机的基础研究,TM37
  11. AVS视频解码器在PC平台上的优化及场解码的改善,TN919.81
  12. 多重ANN/HMM混合模型在语音识别中的应用,TN912.34
  13. AES算法及其DSP实现,TN918.1
  14. 多层卫星网络稳定性设计研究,TN927.23
  15. 电视制导系统中视频图像压缩优化设计及实现研究,TN919.81
  16. 海量多数据库集成系统的查询处理研究,TP311.13
  17. 扩展青霉TS414脂肪酶在毕赤酵母的表达、纯化及其催化外消旋萘普生酯化拆分的研究,Q814
  18. 米曲霉FS-1脂肪酶发酵优化、分离纯化与酶学特性的研究,TQ925.6
  19. 灰黄霉素产生菌FS80的诱变与选育研究,TQ927
  20. 壳聚糖及其衍生物脱除牡蛎中麻痹性贝类毒素的研究,TS254.4
  21. 大红山铁矿井下人员跟踪定位系统的优化研究,TN929.5

中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 发酵法制氨基酸 > 丙氨酸
© 2012 www.xueweilunwen.com