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生物转化法生产β-丙氨酸的研究
作 者: 楼坚
导 师: 裘娟萍
学 校: 浙江工业大学
专 业: 生物化工
关键词: HPLC-ELSD 藤黄八叠球菌 生物转化 诱变 优化 壳聚糖 固定化
分类号: TQ922.2
类 型: 硕士论文
年 份: 2006年
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内容摘要
本论文通过对纸层析法、高锰酸钾滴定法和高效液相色谱的比较,建立了HPLC-ELSD直接检测β-丙氨酸的新方法。该方法色谱条件为:色谱柱为5μm Alltech氨基柱,柱温为40℃,流动相为甲醇:水=5:1,流速为1.0mL/min,检测器为蒸发光散射检测器Alltech2000(U.S.A.),检测器工作条件为飘移管温度85℃,气体流速2.2L/min。从全国8个地点采集土壤,筛选到26株耐丙烯酸菌株。将26株菌株和藤黄八叠球菌(Sarcine luted)同时发酵、转化后比较产β-丙氨酸合成酶能力,结果藤黄八叠球菌转化得到的β-丙氨酸含量为0.102g/L,高于其他26株菌株。对藤黄八叠球菌进行(60)Coγ射线诱变和紫外诱变,在高浓度丙烯酸培养基和发酵残液培养基上培养,筛选得到β-丙氨酸合成酶产生菌TH0517A,β-丙氨酸合成酶活力为20.5U,较诱变前提高酶活28.97%。采用单因素及正交实验法,对诱变株TH0517A酶合成条件进行优化,优化后的酶合成条件:可溶性淀粉2.3g,硝酸钾0.8g,H3BO33.4μg,ZnSO4 8.1μg,MgSO4·7H2O 0.02g,KH2PO4 0.7g,NaCl 0.145g,定容100mL,NaOH调pH 7.0,发酵温度30℃,转速200 r/min,发酵时间18h。通过对酶合成条件的优化,突变株TH0571A酶活达到了54.4U,较优化前提高了200.41%。对转化工艺条件进行单因素优化实验,优化后的工艺条件为:二级发酵液发酵完毕后,直接作为酶液使用;转化液配方:6%丙烯酸,1%10-5mol/LZnSO4,1%10-5mol/L CuSO4,0.02%MgSO4.7H2O,配置方法:添加丙烯酸后,用0.1%Ca(OH)2调节pH值至7.0,冷却至室温,然后添加各种离子,最后氨水调pH值至10.0。转化时每15mL转化液添加9mL发酵液,30℃转化10h。实验结果显示,突变株TH0571A转化率达到了1.25%,较优化前提高了138%。采用戊二醛交联壳聚糖固定化方法,对β-丙氨酸合成酶进行固定。将壳聚糖凝胶与质量分数为0.4%的戊二醛混合,室温下搅拌交联3h,水洗至无戊二醛,以每克干壳聚糖添加40mL酶液将粗酶液添加到交联好的壳聚糖凝胶中,0℃固定化2h,抽滤洗涤后即得固定化β-丙氨酸合成酶。该方法酶活回收率达到43.16%。
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全文目录
摘要 4-6 Abstract 6-16 第一章 综述 16-30 1.1 β-丙氨酸的理化性质 16-17 1.2 β-丙氨酸在生物体内的主要合成代谢途径 17-21 1.2.1 β-丙氨酸在不同生物中的代谢 18-21 1.2.1.1 微生物体内的代谢 18-20 1.2.1.2 动物体内的代谢 20-21 1.2.1.3 植物体内的代谢 21 1.3 β-丙氨酸的生理功能 21-23 1.3.1 合成泛酸、肌肽等物质 22 1.3.2 SNCD系统中一种有效的神经传递素 22 1.3.3 N-β-丙氨酰多巴胺(NBAD)的前体 22-23 1.3.4 神经传导抑制结构类似物 23 1.4 β-丙氨酸的主要应用 23-26 1.4.1 肌肽 23-24 1.4.2 氟化甲基β-丙氨酸衍生物 24 1.4.3 喜树碱β-丙氨酸酯 24 1.4.4 聚β-丙氨酸 24-25 1.4.5 泛酸钙的合成 25 1.4.6 人工合成糖配基库 25 1.4.7 β-丙氨酸金属配合物 25-26 1.5 β-丙氨酸的生产 26-28 1.5.1 丙烯腈法 26 1.5.2 β-氨基丙腈法 26-27 1.5.3 琥珀酰亚胺(丁二酰亚胺)降解法 27 1.5.4 丙烯酸法 27-28 1.6 选题背景和意义 28-30 第二章 分析方法的建立 30-43 2.1 材料与方法 30-34 2.1.1 材料 30-31 2.1.2 仪器设备 31 2.1.3 方法 31-34 2.1.3.1 纸层析法定性分析产物β-丙氨酸 31 2.1.3.2 酸性高锰酸钾滴定法定量分析底物丙烯酸 31-32 2.1.3.3 HPLC-ELSD法测定β-丙氨酸 32-33 2.1.3.4 离子交换法样品预处理 33-34 2.2 结果与讨论 34-40 2.2.1 纸层析法定性分析产物β-丙氨酸 34-35 2.2.2 酸性高锰酸钾滴定法定量分析底物丙烯酸 35-36 2.2.2.1 0.1mol/L高锰酸钾溶液的配制及标定 35-36 2.2.2.2 高锰酸钾滴定标准曲线 36 2.2.3 HPLC-ELSD法测定β-丙氨酸 36-40 2.2.3.1 标样β-丙氨酸测定 36-37 2.2.3.2 流动相的选择 37 2.2.3.3 HPLC-ELSD测定β-丙氨酸的标准曲线 37-39 2.2.3.4 HPLC-ELSD测定β-丙氨酸的回收率 39 2.2.3.5 样品预处理中β-丙氨酸的回收率 39-40 2.2.3.6 β-丙氨酸转化率计算方法 40 2.3 本章小结 40-43 2.3.1 纸层析法定性分析产物β-丙氨酸 40-41 2.3.2 酸性高锰酸钾滴定法定量分析底物丙烯酸 41 2.3.3 高效液相色谱法测定β-丙氨酸 41-42 2.3.4 小结 42-43 第三章 菌种选育 43-53 3.1 材料与方法 43-47 3.1.1 菌种来源 43 3.1.2 土壤来源 43 3.1.3 培养基及培养条件 43-45 3.1.3.1 土壤筛选培养液 43 3.1.3.2 斜面培养基及培养条件 43-44 3.1.3.3 平板筛选培养基及培养条件 44 3.1.3.4 摇瓶培养基及培养条件 44-45 3.1.4 转化液配制 45 3.1.5 主要材料 45 3.1.6 主要仪器设备 45-46 3.1.7 方法 46-47 3.1.7.1 耐丙烯酸菌株的富集方法 46 3.1.7.2 耐丙烯酸菌株的筛选 46 3.1.7.3 转化方法 46 3.1.7.4 耐丙烯酸菌株产物的检测 46-47 3.2 结果与讨论 47-50 3.2.1 耐丙烯酸菌株的富集 47-48 3.2.2 耐丙烯酸菌株的筛选 48-49 3.2.3 最佳菌株的确定 49-50 3.3 本章小结 50-53 第四章 菌种诱变选育 53-64 4.1 材料与方法 53-56 4.1.1 菌种来源 53 4.1.2 培养基及培养条件 53-54 4.1.2.1 斜面培养基及培养条件 53 4.1.2.2 平板筛选培养基及培养条件 53 4.1.2.3 发酵残液培养基及培养条件 53 4.1.2.4 摇瓶培养基及培养条件 53-54 4.1.3 转化液配制 54 4.1.4 主要材料 54 4.1.5 主要仪器设备 54 4.1.6 方法 54-56 4.1.6.1 菌种活化 54 4.1.6.2 出发菌的耐丙烯酸检测 54 4.1.6.3 相对酶活的测定 54-55 4.1.6.4 诱变处理 55 4.1.6.5 ~(60)Coγ射线诱变 55 4.1.6.6 紫外线诱变 55 4.1.6.7 耐丙烯酸突变株的筛选 55 4.1.6.8 突变株的稳定性考察 55-56 4.1.6.9 分析方法 56 4.2 结果与讨论 56-62 4.2.1 出发菌耐丙烯酸的能力 56 4.2.2 酶活计算 56-57 4.2.3 诱变处理结果 57-62 4.2.3.1 ~(60)Coγ射线诱变处理 57-60 4.2.3.2 紫外线诱变结果 60-62 4.2.4 突变株稳定性研究 62 4.3 本章小结 62-64 第五章 酶合成条件的优化 64-79 5.1 材料与方法 64-67 5.1.1 菌种来源 64 5.1.2 斜面培养基及培养条件 64 5.1.3 摇瓶培养基及培养条件 64 5.1.4 转化液配制 64 5.1.5 主要材料 64 5.1.6 主要仪器设备 64 5.1.7 方法 64-67 5.1.7.1 摇瓶发酵工艺的确定 65-66 5.1.7.2 发酵培养基的优化 66-67 5.2 结果与讨论 67-78 5.2.1 摇瓶发酵工艺的优化 67-71 5.2.1.1 生长曲线的绘制 67-68 5.2.1.2 生长周期对产酶的影响 68 5.2.1.3 转速对产酶的影响 68-69 5.2.1.4 温度对发酵的影响 69 5.2.1.5 底物丙烯酸对产酶影响 69-71 5.2.2 发酵培养基的优化 71-78 5.2.2.1 单因素实验 71-74 5.2.2.1.1 碳源研究结果 71-72 5.2.2.1.2 氮源研究结果 72-73 5.2.2.1.3 无机盐实验 73-74 5.2.2.2 正交实验 74-77 5.2.2.3 最佳发酵条件优化组合的验证 77-78 5.3 本章小结 78-79 第六章 转化酶促反应的初步研究 79-94 6.1 材料与方法 79-83 6.1.1 菌种来源 79 6.1.2 斜面培养基及培养条件 79 6.1.3 摇瓶培养基及培养条件 79 6.1.3.1 一级种子培养基及培养条件 79 6.1.3.2 二级发酵培养基及培养条件 79 6.1.4 粗转化液配制 79 6.1.5 主要材料 79-80 6.1.6 主要仪器设备 80 6.1.7 方法 80-83 6.1.7.1 酶促转化反应的确定 80 6.1.7.2 细胞破壁对酶活性的影响 80 6.1.7.3 加酶量对转化反应的影响 80-81 6.1.7.4 丙烯酸浓度对转化反应的影响 81 6.1.7.5 氨水调不同pH值对转化反应的影响 81 6.1.7.6 不同丙烯酸盐对转化反应的影响 81-82 6.1.7.7 温度对转化反应的影响 82 6.1.7.8 转化时间对转化反应得影响 82 6.1.7.9 金属离子对转化反应的影响 82 6.1.7.10 转化体系对转化反应的影响 82 6.1.7.11 转化液自发反应产生β-丙氨酸的测定 82-83 6.2 实验结果 83-92 6.2.1 酶促转化反应的确定 83 6.2.2 细胞破壁对产酶的影响 83-84 6.2.3 加酶量对转化反应的影响 84-85 6.2.4 丙烯酸浓度对转化率的影响 85 6.2.5 不同pH值对转化反应的影响 85-86 6.2.6 不同丙烯酸盐对转化反应的影响 86-88 6.2.7 温度对转化反应的影响 88 6.2.8 转化时间对转化反应的影响 88-89 6.2.9 在转化液中添加不同的离子种类对转化率的影响 89-90 6.2.10 不同底物添加剂对转化反应的影响 90-91 6.2.11 转化液自发反应产生β-丙氨酸的测定 91-92 6.2.12 转化条件的优化 92 6.3 本章小结 92-94 第七章 固定化β-丙氨酸加氨酶的初步研究 94-102 7.1 材料与方法 94-96 7.1.1 菌种来源 94 7.1.2 斜面培养基及培养条件 94 7.1.3 摇瓶培养基及培养条件 94 7.1.3.1 一级种子培养基及培养条件 94 7.1.3.2 二级发酵培养基及培养条件 94 7.1.4 转化液配制 94-95 7.1.5 主要材料 95 7.1.6 主要仪器设备 95 7.1.7 方法 95-96 7.1.7.1 酶液的置备 95 7.1.7.2 固定化方法的确定 95-96 7.1.7.3 以壳聚糖为载体的酶固定化方法优化 96 7.2 结果与分析 96-100 7.2.1 固定化方法的选择 96-98 7.2.2 戊二醛质量浓度的确定 98 7.2.3 最优化的固定化条件的确定 98-100 7.3 本章小结 100-102 第八章 展望 102-104 参考文献 104-110 致谢 110-111 攻读学位论文期间发表的学术论文目录 111
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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 发酵法制氨基酸 > 丙氨酸
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