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基于磷酸酯的高分子作为药物及基因输运载体的研究

作　者: 唐凌燕
导　师: 王均
学　校: 中国科学技术大学
专　业: 细胞生物学
关键词: 药物输送基因输送磷酸酯胶束聚合物谷胱甘肽响应性聚乙烯亚胺
分类号: Q789
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

研究和开发具有良好性能的药物和基因输送载体是目前生物医学领域的重要研究方向。本论文针对药物和基因的输送设计合成了两种性能优越的载体材料,并对它们的性能进行了研究。我们设计合成了一种还原响应性的纳米药物载体,载体材料是由二硫键连接的两亲性嵌段聚合物PCL-SS-PEEP,含有疏水性聚己内酯嵌段和亲水性聚2-乙氧基-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环戊烷嵌段。载体材料的化学结构经凝胶渗透色谱(GPC)和1H NMR等表征手段验证。PCL-SS-PEEP在水溶液中自组装形成胶束纳米粒,芘荧光探针法测得其临界胶束浓度为3.1×10-3 mg mL-1,透射电子显微镜(TEM)观察和动态光散射(DLS)检测表明胶束的粒径在100 nm左右且分布均匀。该胶束与10 mM谷胱甘肽(GSH)共培养时,DLS检测颗粒粒径随时间延长显著增大,显示在GSH作用下载体聚合物二硫键断裂破坏了胶束的结构,并因此造成团聚。通过疏水相互作用可以将阿霉素(DOX)包载到胶束内核中,而且DOX从胶束的释放具有GSH浓度响应性,在较高GSH浓度下DOX的释放更快。在细胞实验中,用谷胱甘肽单乙酯(GSH-OEt)处理A549细胞,构建了胞内富集GSH的细胞模型,将载有DOX的胶束纳米粒和A549细胞培养,激光共聚焦和流式细胞检测表明,经GSH-OEt处理的A549细胞内阿霉素荧光比未经GSH-OEt处理的A549细胞增强,表明GSH-OEt处理的A549细胞内高的GSH浓度造成更多的DOX在胞内快速释放。此外,在相同DOX剂量下,和载有DOX的胶束纳米粒共培养的细胞存活率随加入GSH-OEt浓度的增加而下降,也说明PCL-SS-PEEP胶束的GSH响应性的药物释放行为。这种智能化的胞内药物输送和释放为药物输送的纳米载体的设计提供了新的思路。在基因输送载体的研究中,通过聚乙烯亚胺和2-乙氧基-2-氧-1,3,2-二氧磷杂环戊烷的化学反应获得了具有不同磷酸酯修饰度的聚乙烯亚胺衍生物(PEI-EEP),利用1H和31P NMR表征了聚合物的结构并初步推测了反应进行的机理。这一系列PEI-EEP聚合物表现出与PEI类似的缓冲能力,在较低的N/P比下完全结合DNA。我们用DLS的手段研究了不同修饰度的PEI-EEP与DNA在不同N/P下结合形成复合物的粒径和电势的变化趋势,同时用噻唑蓝(MTT)细胞活性证明PEI-EEP聚合物与PEI相比,对HEK293和HeLa细胞均显示低的细胞毒性,而且随修饰度的增加而下降。PEI-PEEP对HEK293和HeLa的体外转染实验结果表明其转染效率与修饰度密切相关,每个PEI分子中含EEP修饰度为52和75的PEI-EEP聚合物表现出比PEI高的转染效率,当EEP修饰度增加至116个时,聚合物的转染效率则显著下降。此外,与无血清时相比,PEI-EEP聚合物在血清存在时表现出更高的转染效率。综合上述,PEI-EEP聚合物可以同时表现出高的转染效率和低的细胞毒性,表明PEI-EEP有潜力成为基因输送的载体材料。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第1章绪论  11-19
  1.1 生物医用高分子材料的研究现状  11-19
    1.1.1 生物医用高分子材料的概念  11
    1.1.2 生物医用高分子材料的种类  11-12
    1.1.3 生物医用高分子材料的特点  12-13
    1.1.4 生物医用高分子材料的生物安全性评价  13-14
      1.1.4.1 组织相容性  13
      1.1.4.2 血液相容性  13-14
    1.1.5 生物医用高分子材料的应用举例  14-17
    1.1.6 生物医用高分子材料的发展  17-19
第2章谷胱甘肽响应性 PCL-SS-PEEP 作为药物载体的研究  19-42
  2.1 引言  19
  2.2 智能化纳米载体研究进展  19-21
    2.2.1 pH 响应性纳米载体  19-20
    2.2.2 温度响应性纳米载体  20
    2.2.3 氧化还原刺激响应性纳米载体  20-21
  2.3 选题目的与内容  21-22
    2.3.1 选题目的  21
    2.3.2 研究内容  21-22
  2.4 材料和方法  22-27
    2.4.1 实验材料  22
    2.4.2 嵌段共聚物 PCL-SS-PEEP 的合成  22-23
    2.4.3 嵌段共聚物 PCL-SS-PEEP 的表征  23
    2.4.4 PCL-SS-PEEP 纳米颗粒的制备及结构表征  23-24
    2.4.5 PCL-SS-PEEP 纳米颗粒细胞毒性测定  24
    2.4.6 PCL-SS-PEEP 纳米颗粒二硫键敏感性测试  24
    2.4.7 包载 DOX 的 PCL-SS-PEEP 纳米颗粒的制备及表征  24-25
    2.4.8 载药 PCL-SS-PEEP 纳米颗粒的二硫键敏感性测试  25-26
    2.4.9 载药 PCL-SS-PEEP 纳米颗粒不同 GSH 浓度下的药物释放  26
    2.4.10 细胞培养  26
    2.4.11 激光共聚焦及流式细胞计数表征载药纳米颗粒对谷胱甘肽的敏感性  26-27
    2.4.12 细胞毒性实验  27
  2.5 实验结果与讨论  27-41
    2.5.1 嵌段共聚物 PCL-SS-PEEP 的合成与表征  27-30
    2.5.2 PCL-SS-PEEP 纳米颗粒的表征  30-33
    2.5.3 PCL-SS-PEEP 纳米颗粒的细胞毒性测定  33
    2.5.4 包载DOX 的PCL-SS-PEEP 纳米颗粒的表征  33-35
    2.5.5 PCL-SS-PEEP 纳米颗粒二硫键敏感性测试  35-36
    2.5.6 载药 PCL-SS-PEEP 纳米颗粒的敏感性测试  36-37
    2.5.7 载药 PCL-SS-PEEP 纳米颗粒的药物释放  37-38
    2.5.8 载药纳米颗粒的胞内药物释放  38-40
    2.5.9 细胞毒性实验  40-41
  2.6 结论  41-42
第3章磷酸酯修饰的聚乙烯亚胺作为基因载体的研究  42-62
  3.1 前言  42-44
    3.1.1 基因治疗  42
    3.1.2 基因治疗的载体分类  42-44
  3.2 选题目的及研究内容  44-45
    3.2.1 选题目的  44-45
    3.2.2 研究内容  45
  3.3 实验材料与方法  45-50
    3.3.1 实验材料  45-47
    3.3.2 酸碱滴定实验  47
    3.3.3 抽提质粒pEGFP-N2 和pGL3  47
    3.3.4 质粒DNA pEGFP-N2 与PEI-EEP 结合实验  47-48
    3.3.5 PEI-EEP 与DNA 按不同比例结合后粒径和电势的变化  48
    3.3.6 PEI-EEP 和PEI-EEP/DNA 对不同细胞的毒性  48-49
    3.3.7 研究 PEI-EEP 作为基因载体转染不同细胞的能力  49-50
      3.3.7.1 转染质粒pEGFP-N2  49
      3.3.7.2 转染质粒pGL3  49-50
  3.4 实验结果与讨论  50-60
    3.4.1 PEI-EEP 的合成与表征  50-52
    3.4.2 载体的质子缓冲能力评价  52
    3.4.3 PEI-EEP 结合pDNA 形成复合物的能力  52-53
    3.4.4 PEI-EEP/pDNA 复合物的粒径和电势  53-54
    3.4.5 PEI-EEP 和PEI-EEP/pDNA 的细胞毒性  54-56
    3.4.6 PEI-EEP/pDNA 的基因转染能力  56-60
  3.5 结论  60-62
参考文献  62-68
致谢  68-69
在读期间发表的学术论文与取得的研究成果  69

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