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黄鳝和欧洲鳗鲡胃蛋白酶原的分离纯化与酶的性质研究

作　者: 吴涛
导　师: 苏文金；曹敏杰
学　校: 集美大学
专　业: 食品科学
关键词: 黄鳝欧洲鳗鲡胃蛋白酶原胃蛋白酶纯化性质研究
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

胃蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶家族中专门水解蛋白质中疏水性氨基酸残基的肽链内切酶,在鱼体内起着重要的生理和消化功能。在低温下仍然具有高活性的鱼体胃蛋白酶对食品加工、鱼类饵料配置具有重要意义。但是,迄今为止国内外对淡水鱼胃蛋白酶的报道较少。本研究以淡水黄鳝和欧洲鳗鲡为材料,通过硫酸铵盐析、DEAE-Sephacel离子交换层析以及Sephacryl S-200、Superdex 75凝胶过滤层析等方法分别从黄鳝胃内纯化得到四种胃蛋白酶原,从欧洲鳗鲡胃内纯化得到三种胃蛋白酶原,并对相应酶的性质进行了比较分析。本研究为胃蛋白酶的开发利用提供了实验依据,并为这两种极具经济价值鱼类的消化生理研究打下基础。胃蛋白酶原是胃蛋白酶的前体,在酸性条件下酶原从N端失去30-50个氨基酸残基片段后转变成活性酶的形式;SDS-PAGE显示纯化得到的四种黄鳝的胃蛋白酶原(PG-I,PG-II,PG-III(A)及PG-III(B))的分子量为36,36,36和35 kDa;相应的四种胃蛋白酶(P-I,P-II,P-III(A)及P-III(B))的分子量分别为32,32,31和32 kDa;欧洲鳗鲡的三种胃蛋白酶原(PG-I,PG-II和PG-III)和相应的胃蛋白酶(P-I,P-II和P-III)的分子量分别约为36,30;37,30;37和30 kDa。以酸变性牛血红蛋白为底物,四种黄鳝胃蛋白酶的最适pH分别为3.5,3.0,3.0和3.0,最适温度分别为40,40,35和35℃;欧洲鳗鲡三种胃蛋白酶的最适pH分别为3.5,2.5和2.5,最适温度分别为40,40和35℃。来自这两种鱼的胃蛋白酶都属于酸性蛋白酶(天冬氨酸蛋白酶),pepstatin是它们的有效抑制剂,但抑制??略有不同。四种黄鳝胃蛋白酶对酸变性牛血红蛋白的Km值和kcat分别为:1.2×10-4 mol/L,23.2 s-1; 8.7×10-5 mol/L,24.0 s-1;6.9×10-5 mol/L, 42.6 s-1; 8.8×10-5 mol/L和25.9 s-1;kcat/Km值依次是1.9×105 mol-1·L·s-1, 2.8×105 mol-1·L·s-1, 6.1×105 mol-1·L·s-1以及3.0×105 mol-1·L·s-1。三种欧洲鳗鲡胃蛋白酶对酸变性血红蛋白的Km值和kcat分别为:8.8×10-5 mol/L,23.7 s-1;9.2×10-5 mol/L,19.4 s-1;7.0×10-5 mol/L和34.4 s-1;kcat/Km依此是2.7×105 mol-1·L·s-1, 2.1×105 mol-1·L·s-1和4.9×105 mol-1·L·s-1。用大鼠抗黄鳍鲷PG-I,PG-II,PG-III和PG-IV多克隆抗体作为一抗,分别与四种黄鳝胃蛋白酶原做Western blot,结果显示黄鳝PG-III(A)和PG-III(B)均能与四种多抗发生强烈的免疫交叉反应,而黄鳝PG-I和PG-II不能与大鼠抗黄鳍鲷PG-III发生免疫交叉反应,与另外三种多抗可以发生免疫交叉反应;欧洲鳗鲡PG-II,PG-III均能与四种多抗发生免疫交叉反应,PG-I只与抗黄鳍鲷PG-I,PG-II多克隆抗体发生免疫交叉反应而不与大鼠抗黄鳍鲷PG-III和PG-IV多克隆抗体发生免疫交叉反应。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章引言  10-23
  1.1 黄鳝  11-12
  1.2 欧洲鳗鲡  12-13
  1.3 胃蛋白酶原的学位论文">胃蛋白酶原及胃蛋白酶  13-20
    1.3.1 胃蛋白酶原及胃蛋白酶简介  13-15
    1.3.2 胃蛋白酶的分离纯化方法  15-17
    1.3.3 胃蛋白酶的研究现状  17-19
    1.3.4 胃蛋白酶的应用研究  19-20
  1.4 本文研究目的与内容  20-23
    1.4.1 研究目的与意义  20
    1.4.2 研究内容、技术路线  20-23
第二章材料与方法  23-32
  2.1 动物  23
  2.2 试剂  23-24
  2.3 实验所用溶液及其配制  24-25
    2.3.1 胃蛋白酶原纯化所用溶液  24
    2.3.2 SDS-PAGE 所用溶液  24-25
    2.3.3 Zymography 所用溶液  25
    2.3.4 Western blot 所用溶液  25
  2.4 仪器  25-26
  2.5 实验方法  26-32
    2.5.1 胃蛋白酶原的分离纯化  26-27
    2.5.2 蛋白质浓度测定  27
    2.5.3 胃蛋白酶活力测定  27
    2.5.4 SDS-PAGE 及Zymography  27-29
    2.5.5 胃蛋白酶原激活过程的研究  29
    2.5.6 pH 和温度对胃蛋白酶活性的影响  29
    2.5.7 抑制剂对胃蛋白酶活性的影响  29
    2.5.8 胃蛋白酶米氏常数的测定  29-30
    2.5.9 免疫交叉反应  30-32
第三章结果与分析  32-50
  3.1 黄鳝胃蛋白酶原的纯化及性质研究  32-40
    3.1.1 黄鳝胃蛋白酶原的纯化  32-34
    3.1.2 分子量测定和纯度鉴定  34-35
    3.1.3 Zymogram  35
    3.1.4 胃蛋白酶原向酶的转化  35-36
    3.1.5 pH 值和温度对黄鳝胃蛋白酶活性的影响  36-37
    3.1.6 抑制剂对黄鳝胃蛋白酶活性的影响  37-38
    3.1.7 黄鳝胃蛋白酶米氏常数的测定  38-39
    3.1.8 免疫同源性分析  39-40
  3.2 欧洲鳗鲡胃蛋白酶原的纯化及性质研究  40-50
    3.2.1 欧洲鳗鲡胃蛋白酶原的纯化  40-44
    3.2.2 分子量测定和纯度鉴定  44
    3.2.3 Zymogram  44
    3.2.4 胃蛋白酶原向酶的转化  44-45
    3.2.5 pH 值和温度对欧洲鳗鲡胃蛋白酶活性的影响  45-46
    3.2.6 抑制剂对欧洲鳗鲡胃蛋白酶活性的影响  46-47
    3.2.7 欧洲鳗鲡胃蛋白酶米氏常数的测定  47-48
    3.2.8 免疫同源性分析  48-50
第四章讨论与结论  50-54
  4.1 讨论  50-52
  4.2 结论  52-53
  4.3 展望  53-54
致谢  54-55
参考文献  55-63
在学期间发表的学术论文目录  63

黄鳝和欧洲鳗鲡胃蛋白酶原的分离纯化与酶的性质研究

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