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不同乳蛋白调控区指导hLF基因在转基因小鼠中表达水平的研究

作　者: 缪明星
导　师: 成勇
学　校: 扬州大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 山羊β-乳球蛋白山羊β-酪蛋白牛αs1-酪蛋白人乳铁蛋白转基因小鼠
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

转基因动物乳腺生物反应器的研究已经成为生物工程领域研究的热点之一;成为高效、高质量生产昂贵生物活性蛋白的有效途径之一;应用乳腺生物反应器生产人的重组蛋白较早期的细菌表达、真核细胞表达系统有产品活性高、成本低的优点,因此某些重组蛋白更适宜利用乳腺生物反应器来生产。外源基因在转基因动物乳腺中特异性表达是转基因动物乳腺生物反应器的根本目的。有许多生物活性蛋白基因在乳蛋白调控序列的指导下已经在转基因动物乳腺中表达,其中应用较多的调控元件有牛αs1-酪蛋白、山羊β-酪蛋白、山羊β-乳球蛋白和小鼠的乳清酸蛋白等。尽管已有应用这些调控序列实现乳腺特异性表达成功的事例,但大多数实验研究中,乳腺特异性表达的成功率低,乳汁中的表达水平较低。本研究选用山羊BLG、山羊β-酪蛋白和牛αs1-酪蛋白三种不同乳蛋白调控序列构建人乳铁蛋白乳腺特异表达载体,制备转基因小鼠并在小鼠乳腺内表达目的蛋白,从而在个体表达水平上探讨不同调控序列对外源基因表达水平的影响,筛选高水平表达载体。本研究选用山羊β-乳球蛋白作为调控元件,构建由山羊BLG5’+CMV+hLF cDNA +Neor+山羊BLG3’组成的乳腺特异表达载体BCL。选用山羊β-酪蛋白作为调控元件,构建由鸡β-globin+山羊β-casein5’+CMV+hLF cDNA+山羊β-casein3’组成的乳腺特异性表达载体PMH。选用牛αs1-酪蛋白作为调控元件,构建由牛αs1-casein5’+CMV+hLF cDNA +牛αs1-casein3’组成的乳腺特异表达载体ACF。通过原核显微注射法制备转基因小鼠,来验证本实验构建的乳腺特异性表达载体的有效性。将BCL质粒用SalI.与NotI限制性内切酶消化,回收纯化约10.6kb的表达载体片段,通过原核显微注射法导入小鼠受精卵雄原核,结果获得65只G0代小鼠,经PCR检测,其中6只小鼠整合有外源基因(♀19#、♀48#、♀59#、♀62、♂11#、♂23#)。将PMH质粒用SalI与NotI限制性内切酶消化,回收纯化约19.1kb的表达载体片段,通过原核显微注射法导入小鼠受精卵雄原核,结果获得56只G0代小鼠,经PCR检测,其中5只小鼠整合有外源基因(♀18#、♀27#、♀28#、♀31#、♂30 #)。将ACF质粒用SalI.与NotI.限制性内切酶消化,回收纯化约10.8kb的表达载体片段,通过原核显微注射法导入小鼠受精卵雄原核,结果获得22只G0代小鼠,经PCR检测,其中3只小鼠整合有外源基因(♀4#、♀13#、♂8 #)。采用酶联免疫法(ELISA)和蛋白印迹(Western Blot)对原代转基因小鼠及的乳汁进行目的蛋白的表达检测。ELISA检测结果表明,BCL转基因小鼠G0乳汁中人乳铁蛋白表达均为阳性,其中平均表达量约为5.874mg/mL;PMH转基因小鼠G0乳汁中人乳铁蛋白表达均为阳性,其中G0代平均表达量约为3.556mg/mL;ACF转基因小鼠G0乳汁中人乳铁蛋白表达均为阳性,其中G0代平均表达量约为3.251mg/mL。Western Blot结果表明,BCL转基因小鼠、PMH转基因小鼠和ACF转基因小鼠的乳汁中所表达的目的蛋白的分子量大小与人乳铁蛋白标准品基本一致(约78 kD)。本实验成功构建了能够指导目的基因在动物乳腺中高效表达的载体BCL、PMH和ACF,而且我们所构建的人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体具有很好的乳腺组织表达特异性,为下一步建立高表达的转基因山羊乳腺生物反应器奠定了基础。

全文目录

摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
符号说明  12-13
第一章文献综述  13-25
  1 乳腺生物反应器研究进展  13-21
    1.1 乳腺特异表达研究概况  13-15
    1.2 乳腺特异性表达调控元件  15-18
      1.2.1 酪蛋白基因调控序列  15-16
      1.2.2 乳球蛋白基因调控序列  16-18
        1.2.2.1 β-乳球蛋白基因调控序列  16-17
        1.2.2.2 乳清酸蛋白基因调控序列  17-18
    1.3 转基因动物制备方法  18-19
    1.4 目前组织特异表达存在的问题及解决方案  19-21
      1.4.1 “位置效应”及其如何克服  19-20
        1.4.1.1 核基质附着区  19-20
        1.4.1.2 位点控制区  20
      1.4.2 酵母人工染色体（YAC）的应用  20-21
  2 人乳铁蛋白的研究进展  21-24
    2.1 人乳铁蛋白的结构  22
    2.2 人乳铁蛋白的生物学功能  22-23
    2.3 利用乳腺生物反应器生产人乳铁蛋白的现状  23-24
  3 展望  24-25
第二章人乳铁蛋白乳腺特异性表达载体的构建  25-37
  1 材料  25-26
    1.1 仪器  25
    1.2 试剂  25-26
    1.3 质粒与菌株  26
    1.4 DNA 分析软件  26
  2 方法  26-28
    2.1 常规分子生物学操作方法  26
    2.2 DNA 回收与纯化  26
    2.3 DNA 片段末端的补平  26-27
    2.4 连接反应体系  27
    2.5 乳腺特异性表达载体BCL 构建  27
      2.5.1 质粒PEH 的构建  27
      2.5.2 质粒BCL 的构建  27
    2.6 乳腺特异性表达载体PMH 的构建  27-28
      2.6.1 质粒PMV 的构建  27-28
      2.6.2 质粒PMH 的构建  28
    2.7 乳腺特异性表达载体ACF 构建  28
      2.7.1 质粒PCEF 的构建  28
      2.7.2 质粒ACF 的构建  28
  3 结果  28-32
    3.1 重组质粒BCL 酶切鉴定结果  28-30
    3.2 重组质粒PMH 酶切鉴定结果  30-31
    3.3 重组质粒ACF 酶切鉴定结果  31-32
  4 讨论  32-37
第三章转基因小鼠制备及整合检测与表达检测  37-52
  1 材料  37-38
    1.1 仪器  37-38
    1.2 试剂  38
    1.3 试验动物  38
    1.4 DNA 分析软件  38
  2 方法  38-43
    2.1 转基因小鼠的制备  38-39
      2.1.1 显微注射片段的准备  38-39
      2.1.2 超数排卵  39
      2.1.3 取卵  39
      2.1.4 显微注射  39
      2.1.5 输卵管胚胎移植  39
    2.2 转基因小鼠的整合检测  39-41
      2.2.1 鼠尾基因组DNA 提取  39-40
      2.2.2 转基因小鼠PCR 方法检测  40-41
    2.3 转基因小鼠乳汁的表达检测  41-43
      2.3.1 乳汁收集及处理  41
      2.3.2 小鼠乳清的提取  41
      2.3.3 转基因小鼠乳清的酶联免疫（ELISA）检测  41-42
      2.3.4 转基因小鼠乳清的的蛋白印迹（Western Blot）检测  42-43
        2.3.4.1 转基因小鼠乳清的SDS-PAGE 电泳  42
        2.3.4.2 转基因小鼠乳汁蛋白的Western Blot 检测  42-43
  3 结果  43-49
    3.1 转基因小鼠整合检测结果  43-47
      3.1.1 BCL 转基因小鼠整合检测结果  43-45
      3.1.2 PMH 转基因小鼠整合检测结果  45-46
      3.1.3 ACF 转基因小鼠整合检测结果  46-47
    3.2 转基因小鼠乳清的酶联免疫（ELISA）检测结果  47-49
    3.3 转基因小鼠乳清的蛋白印迹（Western Blot）检测结果  49
  4 讨论  49-52
结论  52-53
参考文献  53-58
攻读硕士研究生期间发表论文目录  58-59
致谢  59

不同乳蛋白调控区指导hLF基因在转基因小鼠中表达水平的研究

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