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调控表达HCVNS5B蛋白小鼠模型的建立

作　者: 马玉
导　师: 汪爱勤；尹文；吕欣
学　校: 第四军医大学
专　业: 社会医学与卫生事业管理
关键词: HCV NS5B蛋白转基因小鼠模型
分类号: R-332
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
下　载: 23次
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内容摘要

目前全世界有1.7亿人感染了丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV),HCV感染慢性化往往可以发展为严重的肝脏疾病,如脂肪肝、肝硬化和肝癌,严重危害人类健康。迄今为止,尚未有疫苗可以预防HCV感染,而且抗病毒治疗成本高、副作用大,疗效有限。因此丙型病毒性肝炎是继乙型病毒性肝炎之后的又一种引起全球广泛关注的病毒性肝炎传染病。长期以来,人们一直致力于对HCV的防治研究,但是研究进展缓慢。这主要是因为HCV具有较高的变异性,缺乏稳定的HCV感染动物模型,严重阻碍了对HCV致病机制、抗病毒药物筛选和疫苗研究的进程。目前HCV动物模型的研究主要集中在感染动物模型、人-鼠肝脏嵌合小鼠模型和转基因小鼠模型三个方面,但都存在很大的局限性。HCV NS5B是一种RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),在HCV复制中起着关键作用。并且鉴于NS5B的晶体结构已经明确,对其功能的研究也较为深入,因此NS5B是目前抗HCV的理想靶标之一。本研究通过联合使用Tet-on四环素调控系统和Cre/LoxP基因敲除系统,建立了一个可在肝脏组织严格调控表达HCV NS5B蛋白的三转基因小鼠模型,研究内容和结果如下;1.构建受Tet-on和Cre/LoxP系统双重调控的HCV NS5B真核表达载体以真核表达载体pBI-3为载体构建骨架,在其启动子的下游依次插入luc报告基因、BGH PolyA和ns5b基因片段,并分别在luc报告基因的上游和BGH PolyA尾的下游各引入一个LoxP位点,成功构建了可受Tet-on四环素调控系统和Cre/LoxP基因敲除系统双重调节控制的HCV NS5B真核表达载体,命名为PBI-3/luc-BGH PolyA-NS5B。这种双调控设计不但可以更为严格的避免漏过性表达,而且双报告基因的设计为后期实验筛选背景表达低和诱导性强的转基因小鼠提供了简便、灵敏、准确的检测方法。PBI-3/luc-BGH PolyA-NS5B真核表达载体的成功构建为可严格调控HCV NS5B蛋白表达转基因小鼠的建立奠定了良好的基础。2.建立在Dox诱导下可严格调控表达NS5B蛋白的三转基因小鼠将PBI-3/luc-BGH PolyA-NS5B载体线性化后送往上海南方模式生物研究中心制备在Tet-on和Cre/LoxP系统双重调控下表达HCV NS5B蛋白的转基因小鼠,结果获得了6只NS5B转基因小鼠首建鼠(F0)。将该首建鼠进行PCR及Southern bolt鉴定后与C57BL/6小鼠杂交获得第一代小鼠(F1), PCR法筛选ns5b基因阳性小鼠。经筛选获得的ns5b基因阳性的小鼠一部分与C57BL/6小鼠继续交配,繁殖扩群,用PCR法检测其是否能够将外源基因稳定遗传;而另一部分与共表达rtTA和Cre的双转基因小鼠(rtTALAP-1/LC-1)杂交,筛选共表达ns5b、Lap、Cre基因的三转基因小鼠。用PCR法分别检测ns5b基因、Lap基因和Cre基因片段,三种片段均阳性的三转基因小鼠用Dox(盐酸强力霉素)饮水饲喂一周,小鼠腹腔注射荧光素,用小动物在体光学成像分析系统下检测三转基因小鼠肝脏的发光信号,用免疫组化法检测Cre重组酶和NS5B蛋白在小鼠肝脏组织中的表达情况。结果发现三转基因小鼠在Dox诱导一周后,只在肝脏部位采集到强烈的特异性荧光信号,其他部位未采集到信号,说明该三转基因小鼠的调控性和特异性均良好。免疫组化法证实Cre重组酶特异性定位于肝细胞胞核,NS5B蛋白特异性分布于肝细胞胞浆。综上所述,通过联合使用Tet-on四环素调控系统和Cre/LoxP基因敲除系统建立了三转基因小鼠模型,其目的基因NS5B表达的诱导性和肝脏靶向性均良好,为后期评价该三转基因小鼠用于HCV RdRp抑制剂筛选的稳定性和有效性提供了实验基础。

全文目录

缩略语表  5-7
中文摘要  7-10
英文摘要  10-14
前言  14-16
文献回顾  16-27
  一、HCV 的分子生物学特性与抗 HCV 的酶靶研究  16-18
  二、HCV 动物模型研究现状  18-23
  三、Tet 四环素调控系统研究现状  23-24
  四、Cre/LoxP 基因敲除系统研究现状  24-25
  五、联合使用 Tet 四环素调控系统和 Cre/LoxP 基因敲除系统在转基因小鼠中的研究现状  25-27
第一部分构建受Tet-on 和Cre/LoxP 系统双调控的HCV NS5B 真核表达载体  27-45
  1. 材料  27-30
  2. 方法  30-37
  3. 实验结果  37-42
  4. 讨论  42-45
第二部分筛选在Dox 诱导下可严格调控表达NS5B 蛋白的三转基因小鼠  45-64
  1. 材料  45-48
  2. 方法  48-56
  3. 结果  56-62
  4. 讨论  62-64
小结  64-65
参考文献  65-72
附录  72-75
个人简历和研究成果  75-76
致谢  76

调控表达HCVNS5B蛋白小鼠模型的建立

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