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猪圆环病毒Ⅱ型（福州株）的分离与全基因序列的测定

作　者: 叶财旺
导　师: 吴宝成
学　校: 福建农林大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 猪圆环病毒Ⅱ型分离全基因序列
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 85次
引　用: 1次
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内容摘要

猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus type 2,PCV2)所引起的疾病是当今养猪业中严重关切的重大传染病之一。它能造成猪的生长缓慢,饲料报酬降低,同时侵害猪的免疫系统,导致机体的免疫力下降,引起其他疾病的大爆发,给世界各国养猪业的发展造成了严重威胁和巨大的经济损失。PCV2已经在世界范围内广泛存在,现在认为它不仅可以引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS),还与猪皮炎肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪先天性震颤(CT)等疾病密切相关。PCV2的长度有1767bp和1768bp两种,据研究报道,ORF1编码的Rep蛋白与病毒的复制有关,ORF2编码的Cap蛋白是PCV2衣壳的主要成分,具有较好的免疫原性,因此对ORF2的研究已经成为热点。本试验从福州郊区某大型猪场的病猪中采集病料,运用PCR方法对PCV2进行DNA检测;并进而进行全基因序列的扩增和分子结构特征的分析。本分离株经过测序得到,其基因组长度为1767bp,共有11个开放阅读框。其中ORF1有945个碱基,编码314个氨基酸,存在3个糖基化位点(23～25a(aNPS)、256～258aa(NQT)、286～288aa(NAT));ORF2的长度为705bp,编码233个氨基酸,只有一个糖基化位点(143～145aa)。对ORF1和ORF2编码氨基酸的二级结构预测中显示:ORF1的H:α-螺旋,E:β-折叠,空格:其它或无规卷曲各占的比例为24.2%、20.38%、55.41%;ORF2中相对应的比例为6.41%、31.20%、62.39%。同时也预测了ORF2的亲水性和抗原表位,结果表明ORF2表达的蛋白在N端的10左右显示出高度亲水性。其所编码的氨基酸在3～18位、32～43位、84～87位、113～118位、176～181位、227～231位可能存在抗原表位。用DNAstar分析比较了福州分离株与国内外分离株之间的同源性,其结果显示同源性为94.3%～99.8%。经过与国内外毒株的进化发育树的绘制可知,福州分离株和龙岩分离株及其他各株之间的亲缘关系较远,独立在一个分支上,而全部的毒株在地域上没有明显的分布。在对本分离株的两个主要开放阅读框(ORF1、ORF2)进行核苷酸序列以及推导的氨基酸序列分析时可得,福州分离株与加拿大代表株以及省内3个毒株的ORF1核苷酸序列的同源性为97%～99.5%;氨基酸的同源性为97.8%～99%。ORF2核苷酸序列的同源性为91.3%～99.7%;氨基酸的同源性为92.3%～98.7%。由此可知,ORF2的变异大于ORF1。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-10
1. 前言  10-20
  1.1 猪圆环病毒的发现  10-11
  1.2 猪圆环病毒病原学研究进展  11-12
    1.2.1 猪圆环病毒的命名  11
    1.2.2 猪圆环病毒的病毒学分类地位  11
    1.2.3 猪圆环病毒的形态学特性  11
    1.2.4 猪圆环病毒的理化特性  11-12
  1.3 猪圆环病毒的流行病学  12-13
    1.3.1 易感动物  12
    1.3.2 传播途径  12
    1.3.3 流行分布情况  12-13
  1.4 猪圆环病毒的分子生物学特性  13-14
  1.5 猪圆环病毒的复制与转录  14-16
  1.6 猪圆环病毒的致病机理  16-17
    1.6.1 PCV2 的储存  16
    1.6.2 PCV2 感染的组织嗜性  16
    1.6.3 PCV2 引起猪免疫抑制并易造成混合感染  16-17
  1.7 与PCV2 引起的相关疾病简介  17-18
    1.7.1 断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）  17-18
    1.7.2 猪皮炎肾病综合征（PDNS）  18
    1.7.3 仔猪先天性震颤(CT)  18
    1.7.4 猪呼吸道疾病综合征（PRDC）  18
  1.8 猪圆环病毒感染的检测与诊断技术  18-19
  1.9 猪圆环病毒感染的防制  19
  1.10 PCV 相应的疫苗研究进展  19-20
    1.10.1 PCV 灭活疫苗  19-20
    1.10.2 弱毒疫苗  20
    1.10.3 基因疫苗  20
2. 材料与方法  20-26
  2.1 试验材料  20-21
    2.1.1 主要试剂  20-21
    2.1.2 细胞  21
    2.1.3 其它  21
    2.1.4 主要仪器  21
  2.2 实验方法  21-26
    2.2.1 病料处理  21
    2.2.2 接毒  21-22
    2.2.3 电镜观察  22
    2.2.4 猪圆环病毒2 型的全基因克隆  22-26
3. 结果  26-40
  3.1 病毒的分离与电镜观察  26-27
  3.2 PCV2 部分基因的扩增  27
  3.3 PCV2 全基因的扩增  27-28
  3.4 重组质粒的鉴定  28-29
  3.5 福州分离株PCV2 全基因测序及序列分析结果  29-33
    3.5.1 福州分离株PCV2 全基因  29-30
    3.5.2 福州分离株PCV2 的ORF1 核苷酸及推导氨基酸  30
    3.5.3 福州分离株PCV2 的ORF2 核苷酸及推导氨基酸  30-31
    3.5.4 福州分离株ORF1 与ORF2 编码蛋白的二级结构预测  31-32
    3.5.5 福州分离株ORF2 编码蛋白的亲水性和抗原表位分析  32-33
  3.6 PCV2 各毒株的序列分析  33-40
    3.6.1 福州分离株与其他毒株的序列比对  33-34
    3.6.2 福州分离株与其他毒株的进化发育树分析  34
    3.6.3 福州分离株与其他4个毒株的ORF1及ORF2分析  34-40
讨论  40-44
  1.病毒分离的分析  40
  2.PCV2 全基因组的 PCR 扩增的分析  40-41
  3.酶切图谱的分析  41
  4.福州株 PCV2 全基因组的分析  41
  5.福州分离株ORF2亲水性及抗原表位预测分析  41-42
  6.福州分离株与加拿大代表株 AF027217 及省内 3 个毒株 ORF1 和 ORF2 的核苷酸以及推导的氨基酸序列比对和分析  42-43
  7.PCV2 全序列比对及进化树的分析  43-44
结论  44-45
参考文献  45-50
附录  50-69
致谢  69

猪圆环病毒Ⅱ型（福州株）的分离与全基因序列的测定

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