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力生长因子E肽（MGF-Ct24E）与应力作用对成骨细胞基因表达影响的基因芯片分析

作　者: 林福春
导　师: 王远亮
学　校: 重庆大学
专　业: 生物学
关键词: 成骨细胞力生长因子基因芯片增殖分化
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

最近力生长因子(Mechano growth factor, MGF)是生物力学及生长因子研究方面的新热点。MGF是Igf-1基因的选择性剪接变异体,在拉伸刺激的骨骼肌和损伤的神经、肌肉等组织中高表达。进一步研究发现,MGF及其E肽(MGF-Ct24E)能够促进肌肉肥大,损伤修复,并且具有神经保护和心肌保护等功能。本实验室的研究发现在拉伸刺激的成骨细胞中也有MGF mRNA的高表达,提示MGF也可能是骨组织中响应力信号的效应因子,还发现MGF能够调控成骨细胞的增殖分化过程,促进骨缺损修复作用。应力在骨组织的生长、重建过程中发挥了重要的调控作用,骨折损伤部位往往因为缺乏应力而导致愈合后的骨质疏松甚至再骨折现象。因此,本课题比较分析应力与MGF-Ct24E作用后成骨细胞的基因表达谱,寻找两者在骨代谢调控方面的异同,设想以MGF代替应力解决骨损伤修复过程因固定医疗措施使得应力严重降低的问题。主要内容和结论如下:(1)运用组织块培养法培养出新生大鼠颅骨成骨细胞,利用差时黏附法对培养出的细胞进行纯化。通过形态学观察、碱性磷酸酶(ALP)染色、基质前体染色、矿化结节染色等鉴定方法证实该组织块法培养的细胞具有典型的成骨细胞生物学特征,符合后续实验要求。将传代培养至第三代的成骨细胞用于后续实验研究。(2)对细胞施加12%的周期性拉伸刺激和50ng/mL MGF-Ct24E直接作用8h,以静态培养的细胞作为对照组,提取细胞总RNA,进行基因芯片杂交实验分析各组细胞的差异表达基因。以对照组为参照,在力学加载组的细胞中共发现差异表达基因1866条,其中上调1113条,下调753条;在MGF-Ct24E处理组的细胞中共发现差异表达基因1178条,其中上调基因796条,下调基因382条。以力学加载组为参照,分析MGF-Ct24E处理组的细胞发现差异表达基因共602条,其中上调基因290条,下调基因312条。(3)应用Gene Ontology(GO)数据库对筛选出的差异表达基因进行基因本体论分析,分类分析各差异表达基因的功能类型。应力和MGF-Ct24E作用成骨细胞后,得到的差异表达基因所参与调控的GO类型有众多相似之处。这些共同之处主要是关于细胞增殖和分化、细胞周期、骨发育和骨化的调节,细胞迁移及对应力刺激的响应等。除了两者共同调节的表达类型外,应力作用后的差异表达基因还参与调控了肌动蛋白细胞骨架组织、细胞生长、蛋白区域特异性结合和蛋白质二聚化活性等;MGF-Ct24E作用后的差异表达基因还参与调控了软骨发育、细胞骨架、生长因子结合、蛋白激酶结合和受体结合等。以力学加载组为参照,分析MGF-Ct24E处理组的基因表达谱,发现MGF-Ct24E处理组中的差异表达基因主要与胚胎和组织发育、转录与基因表达的正调节等有关。MGF-Ct24E处理组与力学加载组的差异表达基因在调控骨代谢方面有很高的相似性,其差异基因表达的变化趋势与差异表达倍数也基本一致。(4)通过细胞增殖、细胞周期分析和细胞分化检测等实验进一步分析了MGF-Ct24E对成骨细胞生物学活性的影响。结果显示:MGF-Ct24E在成骨细胞生长早期促进了细胞的增殖,抑制了ALP活性;细胞周期分析发现MGF-Ct24E作用组在第一天和第三天S期的细胞所占比例显著高于对照组,细胞增殖指数显著提高,随着培养时间的延长增殖速度逐渐减缓,促增殖效率逐渐降低;在细胞分化晚期,MGF-Ct24E促进了胶原的表达和矿化结节的形成,促进了成骨细胞的分化。说明MGF-Ct24E并非是抑制成骨细胞的分化,而是促进成骨细胞早期的增殖活性,延迟了其分化活性。细胞实验所得结果与基因芯片分析结果一致。综上所述,MGF-Ct24E和应力作用在骨代谢基因表达的调控方面有着极为类似的效应,细胞实验分析再一次证实了MGF-Ct24E促进成骨细胞的增殖,延迟其分化,最终促进骨形成作用。因此,MGF-Ct24E有望能代替应力刺激用于骨损伤修复的临床治疗。

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-11
缩略词列表  11-12
1 绪论  12-17
  1.1 问题的提出及研究意义  12-13
    1.1.1 问题的提出  12-13
    1.1.2 研究意义  13
  1.2 国内外研究现状  13-16
  1.3 本文的研究目的和研究内容  16-17
    1.3.1 本研究的目的  16
    1.3.2 本研究的主要内容  16
    1.3.4 本论文的创新点  16-17
2 成骨细胞的原代培养及鉴定  17-25
  2.1 引言  17
  2.2 成骨细胞的培养  17-19
    2.2.1 实验动物  17
    2.2.2 实验试剂及主要器材设备  17-18
    2.2.3 成骨细胞的原代培养  18
    2.2.4 成骨细胞的传代培养  18-19
    2.2.5 成骨细胞的纯化  19
  2.3 原代成骨细胞的鉴定  19-21
    2.3.1 碱性磷酸酶染色  19-20
    2.3.2 基质前体染色  20
    2.3.3 体外矿化能力检测  20-21
  2.4 实验结果  21-23
    2.4.1 原代成骨细胞形态学观察  21
    2.4.2 碱性磷酸酶（ALP）染色  21-22
    2.4.3 基质前体染色  22
    2.4.4 矿化结节染色  22-23
  2.5 讨论  23-24
  2.6 本章小结  24-25
3 力生长因子 E 肽及应力对成骨细胞基因表达的影响  25-34
  3.1 引言  25
  3.2 实验试剂及主要器材设备  25-26
  3.3 实验方法  26-29
  3.4 实验结果  29-32
    3.4.1 RNA 浓度及纯度检测结果  29
    3.4.2 RNA 完整性检测结果  29-30
    3.4.3 芯片杂交信号扫描  30
    3.4.4 表达谱数据的层级聚类分析  30-31
    3.4.5 差异表达基因筛选  31-32
  3.5 讨论  32-33
  3.6 本章小结  33-34
4 差异表达基因的生物信息学分析及验证  34-46
  4.1 引言  34
  4.2 实验试剂及主要器材设备  34-35
  4.3 芯片数据分析  35
  4.4 RT-qPCR 验证差异表达基因  35-37
    4.4.1 引物设计与合成  35-36
    4.4.2 RNA 提取  36
    4.4.3 RNA 质量检测  36
    4.4.4 cDNA 的制备  36
    4.4.5 qPCR 反应  36-37
  4.5 实验结果  37-43
    4.5.1 力学加载组与MGF-Ct24E 处理组的基因表达谱  37-39
    4.5.2 力学加载组与MGF-Ct24E 处理组基因表达谱的差异  39-40
    4.5.3 力学加载组与MGF-Ct24E 处理组中与骨代谢相关的基因表达  40-41
    4.5.4 RNA 质检结果  41-42
    4.5.5 qPCR 验证结果  42-43
  4.6 讨论  43-45
  4.7 本章小结  45-46
5 力生长因子 E 肽对成骨细胞活性的影响  46-56
  5.1 引言  46
  5.2 力生长因子E 肽对成骨细胞增殖及细胞周期的影响  46-50
    5.2.1 实验试剂及主要器材设备  46
    5.2.2 实验方法  46-47
    5.2.3 实验结果  47-50
  5.3 力生长因子 E 肽对成骨细胞分化活性的影响  50-54
    5.3.1 实验试剂及主要器材设备  50
    5.3.2 实验方法  50-52
    5.3.3 实验结果  52-54
  5.4 讨论  54-55
  5.5 本章小结  55-56
6 结论与展望  56-58
  6.1 主要结论  56-57
  6.2 后续研究工作展望  57-58
致谢  58-59
参考文献  59-66
附录  66
  A. 撰写和发表的论文  66
  B. 参与的科研项目  66

力生长因子E肽（MGF-Ct24E）与应力作用对成骨细胞基因表达影响的基因芯片分析

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